金线莲HPLC指纹图谱研究

李轶奕，刘顺治，谢婷婷，范世明，丘鹰昆*

(1.厦门大学，福建 厦门 361105；2.福建中医药大学，福建 福州 350122)

金线莲(Anoectochilus roxburgii)为兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)植物，叶脉金黄色或紫红色，具清热解毒、消炎止痛等功效[1]。银线莲(Goodyera hachijoensis)属于斑叶兰属(Goodyera)，它是一种呈现白网脉斑状的植物，具有清热解毒、活血化瘀及消肿止痛等功效[2]。近年来，金线莲被大量开发利用，野生资源稀缺，种群数量急剧减少[3—4]。金线莲与银线莲同属兰科，外观及药用功效具有较高相似度，但是二者存在本质的区别，市场上时有将银线莲混作金线莲出售[5]。另外，金线莲组织培养和人工栽培技术也取得一定进展，但由于培养条件的差异，其形态学性状及有效成分有所不同，降低药材质量。为鉴定金线莲药材，Long等[6]建立了兴仁金线莲的 HPLC指纹图谱，标定了20个共有指纹峰。Wu等[7]建立了不同产地金线莲的HPLC指纹图谱，并应用该图谱对银线莲进行质量判断，验证了图谱的可靠性。目前，国内对金线莲的研究主要集中在生物学特性表征、组培、栽培模式优化等方面[8—10]，对有效成分的提取分离纯化鉴定、药材质量标准建立等方面研究较少。本文建立金线莲常见栽培品种及野生样品的HPLC指纹图谱，利用此图谱对金线莲质量进行评判，旨在为金线莲药材鉴别及质量标准的建立提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂

仪器：超声波清洗器(KQ5200V，昆山市超声仪器有限公司)；纯水仪(美国 Millipore)；高效液相色谱仪(Agilent 1100，美国安捷伦科技有限公司)；高效液相-质谱联用仪(LC-20AT，日本Shimadzu)。

试剂：甲醇(色谱纯，Fairfleld，CT，美国)；乙腈(色谱纯，Fairfleld，CT，美国)；甲酸(分析纯，西陇化工股份有限公司)。

1.1.2 药材

南靖产地金线莲样品和银线莲样品购自福建忆闽南金线莲种植有限公司，广西、广东产地金线莲购自当地药农(表1、表2)。

表1 不同类型金线莲来源Table 1 Origin of different Anoectochilus roxburghii materials

表2 三种银线莲来源Table 2 Origin of Goodyera hachijoensis materials

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液制备

药材鲜品经80℃烘箱干燥24 h后，粉碎。精密称取干燥至恒重的药材粉末1 g，置于15 mL离心管中，加入10 mL甲醇，称重，超声提取30 min，以甲醇补足重量，3000 r·min-1离心15 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液，用于HPLC指纹图谱的测定。

以金线莲7号样品的供试品溶液作为条件优化及方法学考察的样本。

1.2.2 色谱条件

采用Kinetex XB-C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm i.d., 5 µm)以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0→10→20→45→70→100→110 min，0%→3%→10%→20%→40%→100%→100%B)，流速为1.2 mL·min-1；柱温为室温；进样量为10 μL；检测波长为260 nm。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱方法学考察

2.1.1 精密度试验

取供试品溶液，按1.2.1项下色谱方法进行测定，连续进样6次，计算各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果表明：各共有色谱峰相对保留时间的 RSD值为0.02%～0.32%，相对峰面积的 RSD值为0.09%～4.06%，仪器精密度良好，符合指纹图谱研究的技术要求。

2.1.2 稳定性试验

取供试品溶液，按1.2.1项下色谱方法，分别在0、6、12、18、24、36、48 h进样测定，计算各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积。各共有色谱峰相对保留时间的 RSD值为0.01%～1.13%，相对峰面积的 RSD值为0.94%～4.26%。表明供试品溶液在48 h内稳定，符合指纹图谱研究的技术要求。

2.1.3 重复性试验

按1.2.2项下方法平行制备6份供试液，按1.2.1项下色谱方法进样检测，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。各共有峰相对保留时间的 RSD值为 0.04%～1.28%，相对峰面积的 RSD值为2.01%～4.73%。表明该方法重复性良好，符合指纹图谱研究的技术要求。

2.2 HPLC指纹图谱的建立及相似度分析

2.2.1 指纹图谱建立

取14批不同类型金线莲样品，按1.2.2项下方法制备供试品溶液，1.2.1项下方法进行HPLC检测。采取多点校正及自动匹配方式，建立金线莲的指纹图谱及对照指纹图谱，分别如图1、图2所示。

图1 金线莲HPLC指纹图谱Fig. 1 HPLC fingerprint of Anoectochilus roxburghii

图2 金线莲HPLC对照指纹图谱Fig. 2 HPLC reference fingerprint of Anoectochilus roxburghii

2.2.2 共有峰的确定

参照峰的选择：根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》[11]，以内标物作为参照物的指纹图谱，可以将共有峰中其中一个峰(要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰)的峰面积作为 1，计算其他各共有峰面积的比值。在金线莲指纹图谱中，保留时间为46.70 min的峰面积相对较大，保留时间稳定，所以选择为内标参照峰。

共有峰的确定：色谱法采用相对保留时间标定指纹峰。在图1所示不同品种金线莲的HPLC 指纹图谱中，通过对比相对保留时间，确定了24个峰为共有指纹峰(图2)。

对比分离得到的化合物保留时间，确认其中 6个共有峰的成分。其中1号共有峰含有金线莲苷和葫芦巴碱，18号共有峰为异鼠李素-3-O-芸香糖苷，20号共有峰为槲皮素，21号共有峰为山柰酚，22号共有峰为异鼠李素，23号共有峰为Batatasin-Ⅲ。

2.2.3 相似度评价

将HPLC色谱数据导出AIA格式文件，导入国家药典委员会提供的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，对14批金线莲药材的特征指纹图谱进行相似度评价，以生成的对照图谱为对照，在相似度计算时采用多点校正方式及自动匹配方式，其结果见附录表5。除S4，S5，S12之外，相似度均在0.91以上，各批样品相似度良好。S4和S5、S12的相似度稍差，分别为0.842、0.822和0.778。

2.2.4 指纹图谱应用

采用人工栽培的银线莲样品，检验所建立的指纹图谱的区分能力。三种银线莲药材粉末按1.2.2项下方法制备供试品溶液，按1.2.1项下色谱条件进行分析，所得的图谱与金线莲对照指纹图谱进行比较，采取多点校正及自动匹配方式计算相似度，见图3。银线莲大棚种植(Y1)、组织培养(阳光照射)(Y2)、组织培养(Y3)与金线莲对照指纹图谱(S4)的相似度分别为 0.529、0.721、0.698，均低于各金线莲样品种内的相似度，根据指纹图谱可以将金线莲样品与相近品种银线莲很好的区分开来。

图3 指纹图谱的应用Fig. 3 Application of HPLC fingerprint

3 讨论

本研究采用HPLC建立金线莲指纹图谱，结果显示，该方法操作简单，重复性好。我们分别考察了不同流动相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液)、不同类型色谱柱(Cosmosil 5C18-MS-II、Cosmosil 5C18-PAQ、Kinetex XB-C18、Ulitimate XB-C18)、不同检测波长(210 nm、230 nm、260 nm、280 nm、310 nm、360 nm)、不同流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)对金线莲指纹图谱色谱峰的影响。结果显示，采用Kinetex XB-C18色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸水为流动相，在260 nm检测波长、流速 1.2 mL·min-1色谱条件下色谱峰的分离度较好且色谱峰数目较多。我们对提取溶剂(水、20%、40%、60%、80%甲醇、乙醇)、提取方式(超声、回流)、提取时间(30 min、45 min、60 min)也进行单因素分析，结果显示，甲醇超声提取得到的色谱峰较其他溶剂数量多，且各色谱峰分布比较均匀，基线平稳。超声和回流提取所测得的图谱无明显差异，但超声提取所需时间短，操作简便。提取时间在30 min时样品已提取完全，45、60 min所得色谱峰数量和面积并无明显增加。因此，我们提取溶剂选用甲醇，提取方式选取超声提取，提取时间选择30 min。

14批药材的 HPLC指纹图谱中，通过计算相对保留时间，标定了 24个共有峰，相对保留时间的RSD在0.034%～1.377%之间，峰面积的 RSD值在27.33%～129.59%。通过与分离得到的化合物保留时间对比，指认了其中6个共有峰。14批样品共有峰的保留时间基本一致，表明该研究所建立的指纹图谱相似度及稳定性都比较高，可为金线莲栽培品种的质量和品种鉴定提供一定的依据；但共有峰的相对面积差异较大，可能与栽培品种、培养模式的不同相关，其规律有待进一步研究。用该指纹图谱对易混淆品种银线莲进行鉴定，三类银线莲样品与金线莲的对照指纹图谱相似度为0.529、0.721、0.698，均低于14批金线莲样品种内的相似度，证实了银线莲和金线莲是有实质性差别的，从而证明了该指纹图谱的可靠性。