角质细胞生长因子-2在金黄色葡萄球菌所致肺部感染中的作用及机制研究

樊 宇，张轶博

(锦州医科大学基础医学院病原生物教研室，辽宁 锦州 121017)

肺部感染是细菌、病毒和真菌等病原微生物所致肺部组织出现炎症病理性改变，患者可出现发热、咳嗽等临床症状[1]。肺部感染在各个年龄阶段皆可发病，其中大型术后、糖尿病、长时间使用呼吸机人群出现肺部感染的概率较高[2]。虽然肺部感染属于临床常见疾病之一，但其除感染外，还会诱发多种并发症，影响机体功能的恢复，因此一旦出现肺部感染，需要及时送医治疗。肺部感染因其致病因素的不同可以分为细菌性、病毒性、真菌性、非典型病原体等肺部感染，其中细菌性肺部感染占比最高[3]。金黄色葡萄球菌是革兰阳性菌，可诱发感染，发生败血症[4]、菌血症[5]、心膜炎[6]和肺炎[7]等。随着甲氧西林耐药株的增多，金黄色葡萄球菌所致感染的治疗难度增加。金黄色葡萄球菌所致感染动物模型也常用于其作用机制研究。角质细胞生长因子-2(Keratinocyte growth factor-2，KGF-2)也称为成纤维细胞生长因子10，可介导上皮间充质细胞的相互作用，在肺组织发育过程中发挥重要作用。研究[8]表明，可以通过KGF-2介导的细胞增殖和炎症反应来改善糖尿病溃疡患者的伤口愈合情况，但是KGF-2在金黄色葡萄球菌所致肺部感染中的作用机制尚不明确，故本研究通过动物模型初步探讨其在金黄色葡萄球菌所致肺部感染中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：6～8周龄清洁级BALB/c小鼠80只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0009。购回后适应性饲养1周，饲养环境为清洁级，实验遵循3R原则。

1.1.2 主要试剂和仪器：KGF-2(批号：2009111)购自北京百奥莱博科技有限公司；金黄色葡萄球菌菌株由中国医学科学院生物技术研究所提供；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(批号依次为1910125、1911104、1905106、1912064、1911162、1908241、1908211)购自上海茁彩生物科技有限公司。多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司；Echo Revolve荧光显微镜购自美国ECHO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与干预：将小鼠分为五组，每组16只，分别为对照组、细菌组、KGF-2低剂量组(2.5 mg/kg)、KGF-2中剂量组(5 mg/kg)和KGF-2高剂量组(10 mg/kg)。对照组经鼻滴入等体积的磷酸缓冲液100 μl，其余各组小鼠均经鼻滴入金黄色葡萄球菌(2×108CFU/ml)100 μl。距离滴入金黄色葡萄球菌悬液1 h后，KGF-2低剂量组、KGF-2中剂量组和KGF-2高剂量组小鼠分别经尾静脉注射2.5、5、10 mg/kg的KGF-2，细菌组和对照组小鼠经尾静脉注射等体积0.9%氯化钠溶液。距离首次滴入细菌悬液24 h后取样进行指标检测。

1.2.2 肺组织病理观察：麻醉处死一部分小鼠，快速取肺。一部分肺组织固定于4%甲醛中性溶液中，经传统石蜡包埋、切片、脱蜡、复水、苏木素-伊红染色、脱水、透明、中性树脂封片后，显微镜下观察肺组织病理结构变化。另一部分肺组织进行湿/干质量比测定。

1.2.3 肺泡灌洗液炎性因子和氧化应激因子水平检测：将分离得到的肺进行支气管肺泡灌洗。一部分灌洗液用于检测中性粒细胞和白细胞水平。另一部分灌洗液以3500 r/min离心10 min，取上清液检测TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO、MDA、MIP-2和T-AOC水平。

1.2.4 肺泡巨噬细胞吞噬功能检测：使用半体法检测小鼠肺泡巨噬细胞的吞噬功能。距离滴入细菌悬液24 h的前30 min时，各组小鼠给予3%鸡红细胞悬液200 μl，30 min后处死小鼠，分离肺组织并进行支气管肺泡灌洗，回收灌洗液并将其滴于玻片上，37 ℃孵育40 min，去除未贴壁细胞后使用甲醇/丙酮固定，吉姆萨染色15 min，纯水漂洗、晾干，在油镜下统计巨噬细胞200个，以及其中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞个数、被吞噬鸡红细胞个数。吞噬百分比=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞个数/200×100%。吞噬指数=被吞噬鸡红细胞个数/200。

2 结 果

2.1 各组小鼠肺组织病理情况比较 见图1。对照组小鼠肺泡排列完整且无组织损伤，细菌组小鼠肺泡有炎性浸润和水肿，KGF-2不同剂量组小鼠肺组织炎性浸润和水肿情况得到明显改善。

2.2 各组小鼠肺组织湿/干质量比和肺泡灌洗液中性粒细胞、白细胞水平比较 见表1。细菌组肺湿/干质量比和肺泡灌洗液中性粒细胞、白细胞水平高于对照组，而KGF-2不同剂量组肺湿/干质量比和肺泡灌洗液中性粒细胞、白细胞水平低于细菌组(均P<0.05)。

A：对照组；B：细菌组；C：KGF-2低剂量组；D：KGF-2中剂量组；E：KGF-2高剂量组

表1 各组小鼠肺组织湿/干质量比和肺泡灌洗液中性粒细胞、白细胞水平比较

2.3 各组小鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平比较 见表2。细菌组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于对照组(均P<0.05)。KGF-2不同剂量组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平低于细菌组(均P<0.05)。

2.4 各组小鼠肺泡灌洗液中氧化应激因子水平比较 见表3。细菌组肺泡灌洗液中MPO、MDA水平高于对照组，T-AOC水平低于对照组(均P<0.05)。KGF-2不同剂量组肺泡灌洗液中MPO、MDA水平低于细菌组，T-AOC水平高于细菌组(均P<0.05)。

2.5 各组小鼠MIP-2水平和肺泡巨噬细胞功能比较 见表4。细菌组肺泡灌洗液中MIP-2水平高于对照组，肺泡巨噬细胞吞噬百分比和吞噬指数低于对照组(均P<0.05)。KGF-2不同剂量组肺泡灌洗液中MIP-2水平低于细菌组，肺泡巨噬细胞吞噬百分比和吞噬指数高于细菌组(均P<0.05)。

表2 各组小鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平比较(pg/ml)

表3 各组小鼠肺泡灌洗液中氧化应激因子水平比较

表4 各组小鼠MIP-2水平和肺泡巨噬细胞功能比较

3 讨 论

肺部感染是临床常见感染性疾病之一，直接影响机体呼吸道功能，重度感染可引起呼吸衰竭甚至死亡。引起肺部感染因素众多，细菌致病性感染是其主要原因[9]。金黄色葡萄球菌是医院感染和社区获得性感染常见致病菌之一，在人体皮肤和黏膜组织中广泛分布，可以引起多种部位感染，其细胞壁含有的肽聚糖、磷脂壁酸为主要抗原成分[10]。金黄色葡萄球菌还可产生毒素因子(细胞表面抗原、酶和毒素)，其产生的毒素对宿主细胞具有降解作用，使宿主反应降低，还可调节机体免疫反应，影响宿主的抗感染能力[11]。金黄色葡萄球菌侵染宿主细胞主要涉及细胞黏附、侵染过程，在宿主细胞内化后可在细胞内存活[12]。本研究通过金黄色葡萄球菌感染模拟临床肺部感染，发现金黄色葡萄球菌感染所致肺部感染小鼠肺组织呈现出明显炎性浸润和水肿，说明金黄色葡萄球菌感染可以引起肺部组织损伤。金黄色葡萄球菌侵染机体后，其表面抗原可被Toll样受体(TLR)2识别，并激活下游磷酸分子，再通过一系列级联反应激活核因子(NF)-κB信号通路，增从而强炎症反应[13]。

KGF-2是成纤维细胞因子家族成员之一，是由208个氨基酸组成的多肽，主要由基质细胞表达和分泌[14]。KGF-2被释放后，可以通过高亲和力与成纤维细胞生长因子(FGF)受体2Ⅲb、1Ⅲb结合，这些受体在上皮和内皮细胞表面分布广泛。由于KGF-2的结构和生物学功能与KGF十分相似，因此KGF-2也具有充当旁分泌介质并促进上皮细胞增殖/分化、血管生成和毛细血管单层屏障功能，还可加速切口愈合，减轻肠道黏膜损伤和修复肠道黏膜屏障[15]。本研究在金黄色葡萄球菌感染小鼠后给予KGF-2干预，结果发现KGF-2可以明显改善肺部感染小鼠肺组织炎性浸润和组织水肿情况，同时还可以部分逆转金黄色葡萄球菌感染所致小鼠肺泡灌洗液中肺湿/干质量比、中性粒细胞和白细胞水平升高趋势，此结果与文献[16]结果趋势一致，说明KGF-2干预可以降低金黄色葡萄球菌感染所致的肺部损伤。

中性粒细胞具有很强的变形游走能力和吞噬活性，能够吞噬病原菌和异物，可在炎症趋化因子的作用下聚集在炎症部位，可作为炎症早期反应的检测指标[17]。本研究结果显示金黄色葡萄球菌所致肺部感染小鼠肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-6、IL-1β、MPO和MDA水平明显升高，T-AOC水平降低，给予KGF-2可以逆转上述趋势。TNF-α、IL-6、IL-1β均为促炎因子，是常用的炎症反应指标之一。MPO是由中性粒细胞嗜天青颗粒释放的一种过氧化物酶，中性粒细胞活化后可促进MPO释放，其水平可以反映机体炎症反应和氧化应激情况[18]。MDA属于脂质过氧化产物，能够反映氧化应激损伤程度。T-AOC是可以体现机体抗氧化能力的指标之一，其水平降低表明机体抗氧化能力减弱[19]。本研究结果说明，KGF-2可以降低肺部感染小鼠肺部炎症反应，提高抗氧化应激能力。

巨噬细胞在机体的天然免疫系统中具有重要作用，在不同组织环境中可产生不同的分化和功能。肺泡巨噬细胞是肺组织主要巨噬细胞类型之一[20]。本研究结果显示，KGF-2可以降低肺泡灌洗液中MIP-2水平并提高泡巨噬细胞的吞噬百分比和吞噬指数。肺泡巨噬细胞不仅具有吞噬功能，还具有炎性因子分泌作用。MIP-2是能够诱导炎症级联反应活化的炎症趋化因子，可由肺泡巨噬细胞和呼吸道上皮细胞分泌产生，能够作用于中性粒细胞[21]。本研究结果说明，KGF-2可能通过抑制肺泡巨噬细胞的促炎功能来改善肺部感染小鼠的肺部炎症反应。

综上所述，KGF-2可以改善金黄色葡萄球菌所致肺部感染损伤，降低肺炎症反应，提高抗氧化应激能力，其作用机制可能与影响肺泡巨噬细胞功能有关，但其中的具体分子机制还需要深入研究。