非洲猪瘟病毒衣壳五邻体顶点蛋白(H240R)原核表达及免疫原性研究

王国强，张怡青，李 果，苏运芳，李玉林，尚立芝， 毕胜利，樊志浩，李生涛，张振强*，王云龙*

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南省生物工程技术研究中心，河南 郑州 450002；3.郑州职业技术学院，河南 郑州 450000；4.南阳农业职业学院，河南 南阳 473000)

【研究意义】非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)引起的家猪、野猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率高可达100%[1-3]。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)将其列为法定报告动物疫病，中国也将其列为一类动物疫病[4]。1921年ASFV首先在肯尼亚被发现，1957年传入欧洲，1971年传入南美，2017年传至俄罗斯并向东扩算至远东地区距离我国仅约1000 km的伊尔库茨克州，2018年传入我国[5-7]。2018年8月，农业农村部通报中国首例非洲猪瘟疫情，随后病毒很快传播到全国大部分地区。至今疫情已扩散至33个省份，超过130万头家猪被扑杀，全国能繁母猪存栏数量从2018年1月的4000万头降至了2019年7月的不足500万头，造成巨大经济损失[8-9]。中国是全世界最大的猪肉生产和消费国，面对近百年来ASFV首次进入及蔓延，我们对其入侵、组装、逃逸机制及相关蛋白相关研究还很不完善，迫切需要研究清楚ASFV功能蛋白作用，尤其是结构蛋白功能，为后期有效疫苗研发和ASFV防控提供支持。【前人研究进展】ASFV是一种独特的双链DNA病毒，直径长约250～260 nm，其基因组十分庞大而复杂，含有 150～167 个开放阅读框(Open reading frames，ORFs)，可编码68种结构蛋白及100多种非结构蛋白，其中一半蛋白功能未知[10-12]，对其病毒入侵、宿主细胞内复制、复制传播、保护性免疫以及逃逸机制仍然知之甚少[13]。这限制了ASFV复制、毒力相关基因的鉴定，以及基因工程疫苗的研制。但是随着冷冻电镜、病毒培养、晶体结构预测分析等技术的成熟，ASFV主要结构蛋白构象、功能、病毒入侵和逃逸机制及相关蛋白逐渐清晰。冷冻电镜结构表明：ASFV具有独特、精巧而复杂的五层结构，从外到内分别是外(囊)膜(Outer membrane)、衣壳(Capsid)、内膜(Inner membrane)、内核心壳(Core shell)以及核心基因组(Nucleoid)，像是一个“俄罗斯套娃”，一层层嵌套，外层衣壳保护着内层蛋白和核酸结构[14-16]。2019年中科院生物物理所饶子和团队解析了高达4.1埃的ASFV衣壳结构，包括1个主要(P72)和4个次要的衣壳蛋白质(M1249L，p17，p49和H240R)，位于衣壳外层的蛋白是五邻体蛋白(Penton)，位于5次轴的顶点，通过分子量估算和二级结构预测，五邻体蛋白为非洲猪瘟病毒中的H240R蛋白。H240R蛋白有240个残基，富含β链，呈现1个单一的胶冻卷曲折叠和约70个氨基酸的N端延伸，推测其在ASFV组装中具有重要作用[14]。同时，H240R蛋白作为结构蛋白，并且位于顶点，推测其在宿主体内可刺激产生强烈免疫反应。【本研究切入点】本研究选择了ASFV BA71V毒株H240R序列(登录号：NP_042812.1)为靶序列，通过密码子优化后，人工合成基因序列，利用基因工程技术构建重组载体pET28a/H，转化大肠杆菌。优化工程菌株诱导和表达条件，目的蛋白以包涵体形式表达。目的蛋白经过包涵体洗涤、亲和层析纯化和复性后，H240R蛋白成功复性，并且可以和阳性血清反应。目的蛋白和ISA201佐剂乳化后，在小鼠体内诱导了抗体产生，抗体在二免后7 d迅速升高，抗体水平持续时间较短。【拟解决的关键问题】由于尚未有报道ASFV衣壳蛋白H240R原核表达及免疫免疫原性研究，因此本项实验可为进一步研究H240R蛋白其结构和功能，以及能否诱导产生保护性应答等方面提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、重组质粒和主要试剂 大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)和质粒pET28a(+)为本实验室保存；pUC57/H载体(含ASFV H240R基因)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并构建；限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA连接酶、DNA Marker(DL5000)购自宝日医生物技术(北京)有限公司，PageRulerTMPrestained Protein Ladder(10～180kDa和5～245 kDa)购自赛默飞世尔科技公司，Ni-NTA 琼脂糖纯化树脂购自美国 QIAGEN 公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside，IPTG)干粉、抗His标签抗体购自北京索莱宝科技有限公司；卡那霉素(Kan)、咪唑购自上海生工生物工程有限公司；小鼠购自郑州大学实验动物中心；ASFV阳性血清(灭活)由洛阳普莱柯生物工程股份有限公司提供；ASFV P72(135～490 aa)原核表达蛋白由河南省生物工程技术研究中心提供，其它化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

表1 PCR用到的引物序列

1.1.2 引物 根据合成并优化后ASFV H240R基因序列设计扩增目的序列引物，上下游引物分别加NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点以及相应保护性碱基，引物见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析 利用 ExPASy 在线分析工具ProtParam(http://web.expasy.org /prot- param/) 分析H240R蛋白的分子量、等电点、氨基酸组成、原子数、稳定疏水性等理化性质。利用软件分析 DNASTAR 软件中的Protean 模块，对H240R 蛋白的二级结构进行分析。使用Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模，预测H240R 三级结构。

1.2.2 重组载体构建 以pUC57/H为模板，引物ASFVH-F/R，扩增目的片段。目的片段和质粒pET28a(+)分别经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切、回收和连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，37 ℃培养10 h，挑选单克隆并扩大培养，菌落PCR、提取质粒双酶切和测序鉴定正确的质粒命为pET28a(+)/H。

1.2.3 目的蛋白表达和纯化 测序正确的重组质粒pET28a(+)/H转化大肠杆菌表达菌株BL(DE3)感受态细胞，37 ℃培养过夜，挑取单克隆于含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中37 ℃培养3～4 h，至OD600nm值为0.5～0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5 mmol/L，小量分别在37 ℃(5 h)、25 ℃(10 h)、16 ℃(20 h)3种不同的温度下诱导，10 000 r/min，离心10 min收集菌体，pH 8.0，20 mmol/L Tris缓冲液(含50 mmol/L Nacl)A重悬菌体，冰浴条件下超声破碎，12 000 r/min离心10 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳鉴定。诱导条件确定后，按照最优条件大量诱导表达，超声破碎菌体，得到包涵体沉淀。

包涵体洗涤缓冲液一(缓冲液A+10 mmol/L EDTA+体积比0.1%的NP-40)重悬包涵体，超声混匀5 min，12 000 r/min离心10 min，沉淀用包涵体洗涤缓冲液液二(缓冲液A+1 mmol/L EDTA+2 mmol/L尿素)重悬洗涤，12 000 r/min离心10 min，沉淀用缓冲液B(20 mmol/L Tris+50 mmol/L NaCl+8 mmol/L尿素)充分溶解，12 000 r/min离心10 min后，上清可作为亲和层析上样的样品。含20 mL Ni2+的柱子用5倍柱体积的缓冲液B平衡，直接上样，流速为2 mL/min，上样结束，用含100 mmol/L咪唑的缓冲液B除杂，再用含300 mmol/L咪唑的缓冲液B洗脱目的蛋白。纯化蛋白通过SDS-PAGE进行分析。

1.2.4 目的蛋白复性和鉴定 目的蛋白复性：利用梯度透析复性目的蛋白，将20 mL含8 mmol/L尿素的目的蛋白装入透析袋(截留分子量10 KDa)，依次用含6 mmol/L尿素+10%甘油、4 mmol/L尿素+10%甘油、3 mmol/L尿素+10%甘油、2 mmol/L尿素+5%甘油、1 mmol/L尿素+5%甘油的缓冲液A，进行透析。最后用缓冲液A透析。透析后蛋白12 000 r/min离心10 min后，上清用超滤管(截留分子量3 KDa)浓缩，浓缩至0.8 mg/mL，0.22 μm无菌针头滤器过滤后，分装-20 ℃保存待用。

免疫印迹：将复性的H240R蛋白SDS-PAGE 电泳，湿转至PVDF 膜，用含5%脱脂奶粉的PBST溶液 37 ℃封闭 2 h，PBST 洗涤3次，每次 5 min，用抗His标签抗体作为一抗37 ℃孵育 2 h，PBST 洗涤3次，使用 HRP 标记的山羊抗鼠二抗(1∶4000) 37 ℃孵育1 h，PBST 洗涤3次，最后用 DAB 显色；斑点-酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)：将复性的蛋白每次3 μL加在NC膜中央，ASFV P 72蛋白(145～490aa)组为阳性对照，未诱导大肠杆菌BL21(DE3)菌体裂解物为阴性，自然风干后，再次滴加，共3次，用含5%脱脂奶粉的PBST溶液 37 ℃封闭2 h，PBST 洗涤3次，用ASFV阳性血清(灭活)作为一抗37 ℃孵育2 h，PBST 洗涤3次，使用 HRP 标记的兔抗猪二抗(1∶2000) 37 ℃孵育 1 h，PBST 洗3次，最后显色。

1.2.5 目的蛋白在小鼠体内刺激产生抗体检测 随机将15只昆明鼠分为3组，阴性组(PBS)和实验组(25和50 μg)，每组5只。阴性对照组用PBS和佐剂(ISA 201)乳化制备，实验组用25和50 μg复性蛋白和佐剂(ISA 201)乳化制备，制备好的疫苗于昆明鼠背部皮下多点免疫，免疫两次，间隔14 d，免疫两次，0和14 d各免疫1次。分别在免疫前(0)、7、14、21、28、35和42 d小鼠尾静脉采血。全血37 ℃放置2 h，4 ℃ 静置4 h， 4000 r/min离心7 min，分离血清-20 ℃待用。用间接ELISA检测抗体水平及消长规律，用碳酸缓冲液(pH 9.6)稀释复性蛋白，100 ng/孔4 ℃包被过夜(12 h)，弃去包被液，用含5%脱脂奶粉的PBST溶液 37 ℃封闭 2 h，250 μL/孔，弃去封闭液，100 μL/孔加入待测血清(1/100稀释)，设置空白对照和阴性对照，37 ℃温育30 min，PBST 洗涤5次，加入HRP 标记的羊抗鼠二抗(1∶8000) 37 ℃温育30 min，PBST 洗涤5次，加入显色剂A(H2O2)和显色剂B(TMB)37 ℃温育10 min，2 mol/L 硫酸终止，酶标仪读数。

2 结果与分析

2.1 ASFV H240R蛋白组成、理化性质及抗原表位等生物信息学分析

ExPASy 在线分析工具显示，H240R蛋白由 240个氨基酸组成，蛋白分子质量为27.7 KDa；等电点为9.40，原子组不稳定系数为 44.28，平均亲水系数为-0.086，为不稳定性亲水蛋白，无跨膜结构域。 DNASTAR 软件预测H240R蛋白表位，有13个抗原表位，抗原指数高(图1-a)。通过Swiss-Model同源建模，得到3个模型，其中与已知T4噬菌体内切核糖核酸酶结构基因结构(第86～188位氨基酸残基)，预测所得H240R蛋白第86～188位氨基酸的蛋白结构，由多个α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲结构组成(图1-b)。

2.2 重组载体构建、鉴定和目的蛋白表达

PCR扩增H240R基因片段，与原核表达载体 pET-28a(+)双酶切后，构建重组质粒pET28a(+)/H，质粒利用双酶切(图2-b)和测序进行鉴定。表达菌株BL21(DE3) /pET28a(+)/H分别在37 ℃(5 h)、25 ℃(10 h)、16 ℃(20 h)3种不同的温度，0.5 mmol/L IPTG下诱导表达，目的蛋白始终以包涵体形式表达(图2-c)，确定诱导表达条件为：0.5 mmol/L IPTG，37 ℃诱导表达5 h。

2.3 目的蛋白纯化和复性

工程菌株BL(DE3) /pET28a(+)/H在0.5 mmol/L IPTG，37 ℃条件下，大量诱导。超声破碎离心后的包涵体蛋白经过洗涤缓冲液洗涤和亲和层析，得到纯化的目的蛋白(图3)。纯化的变性蛋白采用梯度透析进行复性，约有60%蛋白成功复性。

2.4 目的蛋白鉴定

纯化的目的蛋白通过Wstern和DOT-ELISA进行鉴定。Wstern结果显示：复性的H240R蛋白可以抗His抗体反应，大小在33 KDa左右，与预期大小相符(图4-a)。从DOT-ELISA结果可以看出复性的目的蛋白以及ASFV P72(135～490 aa)原核重组蛋白可以和两份阳性血清反应，且复性的H240R和阳性血清反应显色明显高于ASFV P72(135～490 aa)重组蛋白，表明复性的H240R蛋白具有很好的免疫反应性(图4-b)。

2.5 目的蛋白在小鼠体内刺激产生抗体消长规律

取0、7、14、21、28、35和42 d小鼠血清，PBS稀释后(1/100)，用复性H240R蛋白包被的酶标板，通过间接ELISA检测。检测结果显示：第一次免疫14 d，试验组不同剂量(25和50 μg)免疫的小鼠均产生了抗体，二免后7 d(一免后21 d)，抗体迅速升高，50 μg免疫小鼠抗体水平高于25 μg，二免后14 d均达到平台期，不同剂量之间抗体水平没有显著差异，二免后21 d抗体水平开始下降(图5)。抗体水平消长情况说明复性的H240R具有很好的免疫原性，可以在小鼠体内刺激产生高水平的抗体。

3 讨 论

ASFV会导致家猪和野猪的高发病率和死亡率，对两者都具有毁灭性打击，且在经济上具有重大意义的一种疾病，目前世界范围内没有可用的疫苗，控制方法仍为在受影响的地区进行地区隔离和动物扑杀。自2018年ASFV传入我国以来，给我国生猪产业造成巨大损失，这2年间，我国ASFV的防控取得了阶段性成果，疫情发生强度和数量均呈下降趋势，关键环节病毒污染情况得到改善，养殖户生物安全意识明显提高。由于我国生猪养殖体量大，中小养殖户多，养殖环境复杂，防控形式仍很严峻，也出现了新情况：境外疫情输入风险持续存在；病毒分布依然很广，传播途径难以完全阻断，防控工作存在薄弱环节，生猪贩运活动难监管；病毒已在部分野猪群中定殖，根除难度进一步加大[17-18]。针对ASFV防控新形势，我国农村农业部调整防控策略，于2020年8月印发《非洲猪瘟常态化防控技术指南(试行版)》的通知，建立了常态化防控机制。虽然这些措施对目前ASFV防控很有必要，但从长远来看，控制疫情，稳定生猪生产，甚至根除ASFV，还是需要疫苗来完成。因此，包括我国在内的世界其他国家，对ASF疫苗和抗ASFV药物有着强烈的市场需求。

ASFV基因组十分庞大，迄今为止，已经确定了11个完整的ASFV基因组序列，开放阅读框的数量因分离株而异。开放阅读框编码超过200多种蛋白，发现编码结构蛋白就有60多种，其中很多结构蛋白参与基因组复制和病毒感染，以及逃避宿主的防御系统。如pp220、pp62、p72、p54、p30、CD2v、p10、p12、p14.5和p17。pp220和pp62是ASFV多聚蛋白前体，都属于晚期感染蛋白，这些前体蛋白可被蛋白水解酶切割成成熟的病毒体蛋白(p150、p37、p14、p34、p35和p15)，成熟蛋白在病毒衣壳的组装过程中起关键作用。ASFV p54和p30是非常重要的抗原结构蛋白，P54 是 ASFV 表达的早期膜蛋白，介导细胞凋亡，被认为是主要的毒力蛋白之一，同时也介导ASFV在细胞内的转运[19-20]；P30在感染后 2～4 h 产生，在病毒DNA合成开始之前就已经产生并持续表达至病毒生命周期的结束，整个感染期间均持续表达，与病毒入侵宿主细胞有关，主要有参与病毒内化的功能，p30产生的抗体可阻止病毒内吞[21-22]。p72是病毒衣壳二十面体的主要成分，约占病毒蛋白总量的30%左右，具有高度的免疫原性，在病毒感染后期的病毒衣壳形成中非常重要[23-24]。CD2v是 ASFV 外膜蛋白中唯一特征性病毒糖蛋白，类似于 T 淋巴细胞表面粘附受体 CD2，具有吸附红细胞的特性，该蛋白能够识别宿主细胞的膜蛋白并与之结合，帮助病毒粒子吸附在宿主细胞表面和侵入细胞[25-26]。然而，由于ASFV基因编码的绝大多数蛋白功能及作用机制并不清楚，对其结构蛋白、病毒组装以及针对ASFV的抑制基因、逃逸相关蛋白、感染调节因子、天然免疫应答、有效抗体等的研究欠缺，近乎空白，这限制了ASFV复制相关蛋白和毒力相关蛋白的了解，以及相关疫苗的研制。2019年10月，我国首次解析了非洲猪瘟病毒全颗粒的三维结构，发现ASFV的衣壳结构包括一个主要衣壳蛋白质(p72)和4个次要衣壳蛋白质(M1249L、p17、p49和H240R)，其中位于5次轴的顶点的H240R蛋白是ASFV的一个重要蛋白，但其详细结构和功能以及是否能刺激宿主产生中和抗体仍不清楚[14]。

本实验中，H240R蛋白在原核表达系统中，始终以包涵体形式表达。目的蛋白在透析复性时，从含8 mmol/L尿素的缓冲液降低到4 mmol/L时，可很快进行，不会产生蛋白析出，而4 mmol/L尿素减低到3 mmol/L时，蛋白极易析出，透析时间要长，尿素透析浓度下降速度要缓慢。同时，复性的H240R蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠，抗体水平达到平台期后，维持时间较短，是蛋白自身原因，还是蛋白和ISA201佐剂不是最佳配伍，需要进一步研究。ASFV冷冻电镜结构解析推测H240R蛋白在病毒组装有重要作用，其具体作用机制以及其它功能仍未知，虽然H240R蛋白在小鼠体内诱导产生抗体，但这些抗体是否含有中和抗体，能否产生中和保护也需要进一步探究。

4 结 论

本试验人工合成了H240R全基因序列，利用原核表达系统表达目的蛋白，其以包涵体形式存在。目的蛋白通过亲和层析纯化，利用梯度透析进行复性，复性后的H240R蛋白和P72(135～490 aa)蛋白以相同浓度点样做DOT-ELISA，结果显示两者均可以和阳性血清反应，H240R蛋白显色程度更强。同时，H240R蛋白免疫小鼠诱导产生了强的抗体水平，这些表明H240R蛋白具有较好的免疫原性和免疫反应性。总之，H240R蛋白是ASFV一个重要结构蛋白，对其功能进行详细和全面研究，以期能更好了解ASFV的组装、入侵宿主、以及亚单位疫苗研制提供思路。