聚天门冬氨酸尿素对稻田土壤细菌多样性的影响

王 娜，徐嘉翼，叶 鑫，隋世江，张 鑫，牛世伟

(辽宁省农业科学院 植物营养与环境资源研究所，辽宁 沈阳 110161)

【研究意义】土壤微生物是物质循环的调节者，对土壤有机物的分解和养分循环起关键作用，对维持生态平衡稳定具有重要意义[1-3]。微生物作为土壤养分的源和库[4]，可以固定矿质养分，降低养分的损失；另外也参与有机质矿化，释放矿质养分，满足作物的需要。土壤微生物对环境变化较为敏感，除了气候、土壤等自然因素，人为活动也会对微生物产生诸多影响。在农田种植生产中，施肥是必要且常见的人为生产活动，其对微生物群落结构的影响已被广泛报道[5-7]。合理施有机肥或无机肥均能提高稻田土壤微生物的数量和活性，进而调控土壤氮素的循环转化过程，提高土壤有效氮的浓度，促进水稻根系对氮素吸收，因此研究肥料与土壤微生物之间的响应关系对于理解土壤养分调控机制具有指导意义。目前稻田施用的氮肥大多数是常规尿素，其成本低、养分供应快，但长期过量施用易引起养分流失、土壤酸化等问题[8]，导致周围水体富营养化，同时造成土壤质量降低，严重影响了土壤微生物群落结构与功能。常规尿素利用率低，由此带来的环境污染，一直是困扰农业生产的问题[9]。为此，具有肥效长且稳定、利用率高等特点的控释肥料受到越来越多的关注，其对土壤微生物群落结构的影响也成为研究热点[10]。李新悦等[11]研究控释掺混氮肥对稻麦土壤微生物的影响，结果表明在水稻拔节至成熟期，施用控释掺混氮肥的土壤细菌数量较单施尿素提高了54.36%～66.96%，较单施控释氮肥提高19.47%～69.92%。李杰等[12]研究新型聚氨酸增效肥料对土壤微生物量和活性的影响，结果发现新型聚氨酸增效肥料显著增加了小白菜土壤微生物量，提高了土壤微生物活性，能够有效延缓肥料氮素的释放。聚天门冬氨酸/盐(PASP)，是一种环境友好型绿色聚合物，具有生物降解特性及富集离子作用，既能提高肥料利用率，又能减少肥料流失给环境带来的污染，在农业生产中得到大量应用[13-14]。【前人研究进展】杜中军等[15]研究表明聚天门冬氨酸同源多肽分子与养分离子形成易于水稻吸收的螯合态，促进水稻对养分的吸收。杨勇等[16]研究表明PASP能够有效延长肥效，减少化肥流失，活化养分元素，提高化肥利用率，促进水稻增产。【本研究切入点】目前关于PASP研究主要集中在对水稻养分吸收及增产作用等方面，而对土壤微生物群落结构等方面少有报道，尤其能否调控土壤微生物群落结构并影响氮素释放与转化尚不明确。【拟解决的关键问题】本研究选用0.3%聚天门冬氨酸钙盐(PASP-Ca)与尿素复配，利用Illumina高通量测序技术分析稻田土壤微生物群落结构特征，探讨PASP-Ca尿素对土壤微生物多样性和氮素形态的影响。本研究以期掲示PASP与氮素-土壤-微生物间互作的生态学效应。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地位于盘锦市盘山县坝墙子镇烟李村，地处辽河三角洲，属温带半湿润大陆性季风气候类型，年均降雨量612 mm，年均气温8.4 ℃，无霜期165～170 d。供试土壤为水稻土，耕层土壤理化性质为有机质17.7 g/kg、全氮1.58 g/kg、水解性氮71 mg/kg、有效磷43.28 mg/kg、有效钾185.5 mg/kg、pH 7.8。

1.2 供验材料

供试水稻品种为盐丰47号。5月12日施基肥，5月22日插秧，插秧密度为30 cm×16.5 cm，6月24日追蘖肥，10月8日收获水稻。氮肥为大颗粒尿素(N 46%)、磷肥为磷酸二铵(P2O546%、N 18%)、钾肥为氯化钾(K2O 60%)、聚天门冬氨酸钙盐(PASP-Ca，用量为尿素重量0.3%)。

1.3 试验设计

试验共设置2个处理，T1处理氮肥用常规尿素，T2处理氮肥用0.3% PASP-Ca复配常规尿素。各处理氮肥、磷肥和钾肥用量均分别为N 210 kg/hm2、P2O590 kg/hm2和K2O 90 kg/hm2。氮肥施用比例为基肥占80%、蘖肥占20%，磷钾肥全部基施。试验面积为400 m2，每个处理3次重复，随机区组排列。田间管理与当地相同。

1.4 样品采集与测定

在施入基肥后第3、5、10 天，采用5点法取0～20 cm土壤样品。一部分土壤样品迅速装入无菌聚氯乙烯(PVC)盒，置于冰上尽快运至实验室于-80 ℃保存，用于微生物检测。另一部分土壤样品于-20 ℃保存，采用紫外分光光度计法测定土壤硝态氮浓度，靛酚蓝比色法测定土壤铵态氮浓度[17]。

1.5 细菌测序

提取土壤总DNA，然后扩增获得的片段，通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行纯化和回收后，由北京百迈客生物科技有限公司进行文库构建，Illumina MiSeq测序。

1.6 生物信息学数据分析

1.6.1 原始数据序列分析 使用FLASH v 1.2.7软件[18]，通过overlap对每个样品的测序序列(reads)进行拼接，得到的拼接序列即原始Tags数据(Raw Tags)；使用Trimmomatic v 0.33软件[19]，对拼接得到的Raw Tags进行过滤，片段大小得到高质量的Tags数据(Clean Tags)；使用UCHIME v4.2软件[20]，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据(Effective Tags)。

1.6.2 操作分类单元分析 使用QIIME(version 1.8.0)软件[21-22]中的UCLUST对Tags在97%相似度水平下进行聚类，获得操作分类单元(OTU)，并基于Silva(细菌)分类学数据库[23]对OTU进行分类学注释和生物信息学统计分析。用R语言软件绘制群落组成Venn图，展示各处理样品之间共有、特有OTUs数目。

1.6.3 细菌多样性分析 利用Mothur软件[24]计算Alpha多样性指数(Ace、Chao、Shannon、Simpson)。Ace和Chao指数表示物种的数量，Shannon和Simpson指数表示物种的多样性，相同物种丰富度的情况下，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高[25]。

1.6.4 细菌显著差异分析 利用LEfSet[26][Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size]分析首先使用kruskal-Wallis秩和检验方法寻找多组间显著差异的物种(P< 0.05)，然后根据第一步得到的差异物种使用线性判别分析计算每个物种的LDA值，最后根据LDA值筛选组间具有统计学差异的biomarker，进行处理间物种差异显著性分析。LEfSe分析进化分枝图由内至外辐射的圆圈代表了由门至种的分类级别；在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比；着色原则为将无显著差异的物种统一着色为黄色，其他差异物种按该物种所在丰度最高的分组进行着色。

1.6.5 物种与环境因子关联分析 冗余分析法(Redundancy Analysis，RDA)是同时使用环境因子和物种组成数据进行限制性排序的生态学多元数据分析方法，可以综合分析多个环境因子，得出环境因子与物种之间的排序图，图中可直观的显示出物种分布和环境因子间的关联，是分析生物群落结构与环境因子之间相关性的有效途径[27]。

1.7 其它相关数据分析

采用SPSS 19.0软件中独立样本T检验对同采样天数不同施肥处理间Alpha多样性指数和土壤养分进行差异性显著分析；采用SPSS 19.0软件中单因素分析方法(One-Way ANOVA)对同施肥处理不同采样天数间Alpha多样性指数进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌群落总体变化分析

2.1.1 测序数据质量评估 18个土壤样品共得到1030 357条序列，其中921 829条为优质序列，占所有序列的89.5%。平均每个样品的序列条数为16 813，平均序列长度为421 bp。在相似度为97%水平上，18个土壤样品中OTUs数为1188到1791，覆盖了土壤中约为99.45%～99.84%的细菌，说明测序数据量合理，能真实反应土壤细菌的群落组成。

2.1.2 土壤细菌OTUs Venn图分析 从图1可以看出，从施肥后第3天至第10天，常规尿素T1处理与PASP-CA尿素T2处理共有OTUs数呈先增加后降低趋势，且显著高于特有细菌，这表明两个处理的OTUs数可能受尿素降解与转化过程影响，且大部分细菌群落结构相似。在施肥后第5天，T1处理与T2处理OTUs总数最多，分别为1947 和1935种，两处理共有OTUs数也最多，为1910种，这说明PASP-Ca尿素对施肥后第5天土壤细菌OTUs影响较小。而在施肥后第3、10天，T1处理和T2处理特有OTUs分别为18 和49种、24 和87种，且T2处理特有OTUs数均高于T1处理，而在第5天T2处理特有OTUs数低于T1处理，这表明PASP-Ca尿素增加了第3、10天土壤样品中特有OTUs的数量。

2.1.3 土壤细菌Alpha多样性指数 如表1所示，对各处理的OTUs进行Alpha多样性指数分析，发现施肥后第3天至第10天，T1、T2处理ACE指数均呈现先增加后降低趋势，这表明随着尿素的释放与转化，土壤细菌丰富度逐渐增加，在施肥后第5天达到峰值后呈不同趋势下降。其中T1处理第5天ACE指数显著高于第3、10天，T2处理第5、10天ACE指数显著高于第3，5与10天差异不显著，而T2处理第3天ACE指数高于T1处理，第5、10天ACE指数低于T1处理，无显著差异，这说明PASP-Ca尿素可增加施肥初期细菌丰富度且保持施肥后期细菌丰富度相对稳定。两个处理Chao指数也呈现先增加后降低趋势，其中T1处理第5天Chao指数显著高于第3、10天，而T2处理第3、5、10天Chao指数差异不显著，且在第10天T2处理Chao指数显著高于T1处理，这也表明随着尿素的释放与转化，常规尿素处理细菌丰富度变化较大而PASP-Ca尿素能够保持细菌丰富度相对稳定。施肥后第3天，T2处理Shannon指数高于T1处理，且T2处理Simpson指数低于T1处理，无显著差异，这表明在施肥初期，PASP-Ca尿素具有增加土壤细菌多样性的潜力。

表1 各个处理Alpha多样性指数值

2.2 土壤N素硝化相关细菌变化

2.2.1 土壤细菌群落组成 选择物种丰度比例大于1%的前10个优势物种绘制目水平分布柱状图(图2)，并对与氮素循环相关的细菌进行差异显著性分析(表2)。从图2中可以看出，T1、T2处理土壤样品中50%左右为其他物种，10%～20%未能进行分类鉴定。除此之外，Nitrosomonadales(亚硝化单胞菌目)相对丰度最高，其可能是参与氮素循环的主要贡献者，其次为Xanthomonadales(黄单胞杆菌目)、Nitrospirales(硝化螺旋菌目)和Sphingobacteriales(鞘脂杆菌目)。在施肥后第3天，T1处理细菌相对丰度高于T2处理的优势目有：Xanthomonadales，T1处理为9.16%、T2处理为7.32%；其次是Sphingobacteriales，T1处理为4.74%、T2处理为4.47%；而T2处理物种相对丰度高于T1处理的优势目有：主要以未分类细菌为主，占比为11.34%；其次是Nitrosomonadales，T1处理为4.90%、T2处理为5.64%。在施肥后第5天，T1处理细菌相对丰度高于T2处理的优势目有：Nitrosomonadales，T1处理为8.47%、T2处理为5.69%；其次是Nitrospirales，T1处理为4.39%、T2处理为3.29%；而T2处理物种相对丰度高于T1处理的优势目有：主要以未分类细菌为主，占比为18.76%；其次是Sphingobacteriales，T1处理为2.33%、T2处理为2.53%。在施肥后第10天，T1处理物种相对丰度高于T2处理的优势目有：Nitrosomonadales，T1处理为9.73%、T2处理为7.76%；其次是Nitrospirales，T1处理为3.64%、T2处理为2.93%；而T2处理物种相对丰度高于T1处理的优势目有：主要以未分类细菌为主，占比为15.28%；Xanthomonadales，T1处理为3.60%、T2处理为4.01%。可见，常规尿素T1处理和PASP-Ca尿素T2处理的优势物种细菌群落组成基本一样，但优势物种细菌相对丰度存在一定差异。

表2 施肥后第3、5、10天与氮素循环相关细菌目水平的相对丰度

表3 施肥后第3、5、10天土壤细菌属水平LDA打分

如表2所示，在施肥后第3、5和10天，Nitrosomonadales相对丰度呈逐渐增加趋势，其中T1处理第5、10天相对丰度显著高于第3天，而T2处理各时期差异不显著；Nitrospirales相对丰度呈先增加后减少趋势，T1处理第5天其相对丰度显著高于第3天，而T2处理各时期差异不显著；Xanthomonadales、Sphingobacteriales相对丰度呈逐渐减少趋势，T1、T2处理第3天其相对丰度显著高于第5、10天。由此可见，在施肥后第3、5和10天，T2处理中与N素硝化相关的Nitrosomonadales、Nitrospirales相对丰度稳定，这可能与添加PASP-Ca有关。

2.2.2 土壤细菌属水平差异分析 根据LEfSe分析两组间丰度差异显著的物种，红色节点表示在常规尿素T1处理的土壤中起重要作用的细菌类群，绿色节点表示在PASP-CA尿素T2处理的土壤中起重要作用的细菌类群(图3)。如图3所示，在施肥后第3、10天，T1和T2处理均有差异显著的物种，而在第5天，T1处理有3种差异显著的物种，T2处理无差异显著的物种。由于土壤细菌测序获得的数据量较大，将LEfSe分析结果结合LDA打分筛选出LDAScore>3差异显著的菌属(表3)。如表3所示，在施肥后第3天，以Gillisia(泥滩微菌属)、Lysobacter(溶杆菌属)、Pontibacter(海洋杆菌属)等为主的细菌在T1处理的土壤菌群结构组成起到重要作用。Subgroup 7、Nitrospiraceae(硝化螺旋菌科)在T2处理的土壤菌群结构组成起到重要作用。在施肥后第5天，Gillisia、Pontibacter、Geobacter(地杆菌属)在T1处理的土壤菌群结构组成起到重要作用。在施肥后第10天，以Gemmatimonadaceae(芽单胞菌科)、Nitrosomonadaceae(亚硝化单胞科)、Latescibacteria(匿杆菌门)等为主的细菌在T1处理的土壤菌群结构组成起到重要作用。Bacillus(芽孢杆菌属)、Psenudomonas(荧光假单胞菌属)、Streptomyces(链霉菌属)在T2处理的土壤菌群结构组成起到重要作用。上述细菌主要功能与生物防治、生物修复、有机肥降解以及氮循环等相关，其中与N素硝化相关的细菌主要有Nitrospiraceae和Nitrosomonadaceae。在施肥第3天，Nitrospiraceae是T2处理土壤菌群重要组成部分，而在施肥后第10天，Nitrosomonadaceae是T1处理土壤菌群重要组成部分。

表4 不同处理土壤硝态氮、铵态氮含量

2.3 土壤氮素含量变化分析

2.4 细菌群落与土壤氮素的关联分析

3 讨 论

聚天门冬氨酸/盐(PASP)是一种氨基酸类聚合物，天然的聚天门冬氨酸主要存在于软体动物和蜗牛类的壳中[28]。聚天门冬氨酸分子具有类似于蛋白质的酰胺键结构，微生物中相应的酶能够进入PASP的活性位点，使结构主链发生分解并断裂成片段，最终分解为小分子物质(CO2、H2O)，实现完全生物降解[29]。PASP-Ca与尿素复配后可包裹在尿素的外层，通过自身缓慢的生物降解逐渐释放尿素，使氮肥在水稻生育期内持续发挥作用，同时PASP-Ca还能够鳌合、吸附田面水和土壤中的养分输送并富集到水稻根系周围，供水稻吸收利用，这将大大地减少氮素流失与挥发[30-31]。本试验中，通过对各处理的OTUs Venn分析，结果显示：从施肥后第3～10天，两个处理的OTUs数呈先增加后降低趋势，且两个处理的大部分细菌群落结构相似，而PASP-Ca尿素能够增加第3、10天土壤样品中特有OTUs的数量。通过对各处理的OTUs进行Alpha多样性指数分析，结果显示：施肥后第3天至第10天，两个处理的ACE指数和Chao指数呈现增加后降低趋势，其中T1处理第5天ACE指数显著高于第3、10天，T2处理第5、10天的ACE指数显著高于第3天，第5天与第10天差异不显著，且T2处理第3天ACE指数高于T1处理。这表明随着尿素的释放与转化，土壤细菌丰富度逐渐增加，常规尿素处理细菌丰富度变化较大而PASP-Ca尿素处理可增加施肥初期细菌丰富度且保持施肥后期细菌丰富度相对稳定。

4 结 论

本文通过Illumina MiSeq高通量测序技术分析表明，PASP-Ca尿素通过调控参与N素硝化的土壤细菌丰度，改变了土壤细菌群落多样性，影响N素的硝化过程，对降低氮素流失风险和提高氮肥利用率具有潜在作用。本试验仅开展1年，因此有必要通过室内培养试验和大田多年定点试验深入研究PASP与土壤微生物和土壤养分之间的互作关系。