苦荞提取物的化感作用及化学成分分析

马光宗，杨云海，徐高峰，杨韶松，张付斗，申时才，叶 敏

（1云南农业大学/云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201；2云南省农业科学院农业环境资源研究所/云南省农业跨境有害生物绿色防控重点实验室，昆明 650205）

0 引言

植物化感物质是主体植物释放的次生代谢产物，通过自身根系分泌，茎叶雨雾淋溶、挥发或者残体分解等多种途径释放到自然界中，从而抑制或者促进其他植物生长[1]。目前，田间杂草是影响农作物产量和品质的主要因素之一，防控措施以化学除草剂为主，大量除草剂的使用不仅产生了抗药性，更为严重的是其本身高毒、高残留，难以在生态环境中降解[2]。化感作用作为一种环境友好型的生态控草方法受到越来越多的关注。利用作物自身遗传的防御或抗逆能力，很少产生残留等环境危害，对农田杂草生态治理体系具有重要的研究和应用价值[3-4]。因此，研究植物化感作用对植物源除草剂的开发利用以及实现农田杂草生态管理具有重要意义。

苦荞(Fagopyrum tataricum)起源于中国和亚洲北部地区，为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)一年生双子叶作物[5]，具有生育期短、耐冷凉、耐贫瘠、适应性较强等特点，常作为山区、丘陵区轮作换茬的重要作物之一[6]。作为一种重要的小宗杂粮作物和药食同源植物，苦荞在中国主要分布于西南、华北、西北等省区[7]。苦荞含有丰富的营养和保健成分，尤其是在预防糖尿病、高血糖、高血脂等方面有重要作用[8-9]。随着人们对苦荞保健价值的肯定，其营养价值与药用价值、种质资源与农艺性状、栽培技术、遗传多样性等受到广泛的研究[10-11]。有研究表明，金荞麦地上部和地下部不同溶剂提取物对细菌和真菌有一定的抑制作用，抑菌活性成分为一些极性较强的物质[12]，苜蓿和荞麦混播时苜蓿产草与荞麦播种量和产量呈负相关[13]，适量的秸秆还田具有良好的杂草抑制效应及苦荞增产效应[10]，苦荞不同部位提取物对油菜和苜蓿具有明显的化感作用[14]。然而，目前关于苦荞对农田杂草的控制作用、化感作用及其化感物质方面研究甚少。

笔者采用水提液溶剂梯度萃取法提取苦荞化感物质，利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析鉴定萃取物中的化学成分，并以马唐(Digitaria sanguinalis)和三叶鬼针草(Bidens pilosa)2种杂草为受体植物测定了萃取物的化感潜力，以期将苦荞应用于农田杂草控制，为其活性物质用于新型除草剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

苦荞于2020年采自云南省曲靖市师宗县葵山镇，为村民长期种植的本地品种。

马唐和三叶鬼针草为云南省部分主要的农田恶性杂草种类，2019年在云南省各主要分布区采集的种子，经鉴定后保存于云南省农业科学院农业资源环境研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 苦荞萃取物的提取和制备 称取500 g阴干粉碎后的苦荞，其中包括地上部分350 g、地下部分150 g。按1:5(w/w)的固液比加入蒸馏水，浸泡24 h，浸泡期间采用超声波水浴（超声波频率35 kHz，功率500 W，温度25℃）辅助提取，过滤得滤液，再将过滤后的残渣重复上述操作，合并2次提取所得滤液，得到固液比为1:10(w/w)的苦荞水浸提液。采用溶剂梯度萃取法，按溶剂极性从小到大的顺序用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇将所得的水提液顺序萃取4次，合并相应的萃取液，将各有机溶剂萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩，得到相对应的提取物浸膏。将所得到的浸膏分别装入棕色广口瓶中，密封保存与4℃冰箱备用。

1.2.2 苦荞萃取物成分分析 将苦荞石油醚相和乙酸乙酯相萃取物用乙酸乙酯配制成1000 mg/L的溶液，采用GC-MS进行化学成分分析（气相色谱仪Agilent7890，四级杆质谱仪Agilent5975N）。GC分析条件：HP-5MS石英毛细管柱（内径30 m×0.25 mm，膜厚0.25µm）；进样口温度230℃；柱温初始温度40℃，保持2 min，以5℃/min的速率升温至250℃，保持6 min，柱流量为1.0 mL/min；进样量1.0µL；分流比5:1。MS分析条件：电离方式EI，电离能70 eV，四级杆温度150℃，离子源温度230℃，接口温度280℃，扫描质量范围 50～550m/z，载气(He)流速1.0 mL/min，溶剂延迟6 min。2种萃取物GC-MS分析数据采用NIST08标准谱库检索。

1.2.3 生物活性测定 选取大小一致且无残缺、籽粒饱满、发芽率在90.0%以上的马唐和三叶鬼针草种子，用10.0%的次氯酸钠溶液浸泡10 min，蒸馏水漂洗3次，晾干备用。称取一定量萃取物浸膏，先使用少量丙酮溶解（最终浓度为3.0%，前期试验表明不影响植物正常生长），然后用蒸馏水稀释至浓度2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL药液，分别吸取1 mL药液均匀倒入放有双层滤纸铺的直径为3 cm培养皿中，培养皿中均匀放置10粒已消毒的马唐或三叶鬼针草种子，以加入3.0%丙酮的水溶液为对照，各设置3次重复。置于人工气候箱中恒温培养，温度25℃、相对湿度70.0%、出芽后每天光照12 h。试验总萌发时间为7天，试验结束时统计发芽种子数，测量各植株株高、根长。

1.3 数据处理

化感作用响应指数(response index，RI)采用Willamson等[15]的公式计算，如式(1)。

式中，T为处理值，C为对照值。RI>0表示促进作用，RI<0表示抑制作用，RI=0表示既无促进作用也无抑制作用，绝对值的大小与作用强度一致。

采用DPSV 9.50版软件进行数据分析，并采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验，Duncan’s新复极差法进行多重比较，分析不同处理间的差异。采用Excel进行绘图。

2 结果与分析

2.1 苦荞萃取物成分分析

苦荞通过水提液溶剂梯度萃取得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相3种萃取物，得率分别为0.02%、0.06%和0.24%(w/w)。生物测定结果表明，正丁醇相中活性物质成分含量较低，且多数为大分子物质，因此选择石油醚相和乙酸乙酯相进行化学成分分析。利用GC-MS分析法从石油醚相中鉴定出24种含量大于0.5%的化学成分，占总出峰面积的98.7%（图1和表1），主要成分为4-乙基苯酚(26.8%)、5-羟基-6-甲氧基-呋喃并[3，2-g]色烯-7-酮(9.5%)、棕榈酸(9.0%)、4-甲基吲哚(9.0%)、吲哚(8.2%)，其余含量均低于5.0%。从乙酸乙酯相中鉴定出19种含量大于0.5%的化学成分，占总出峰面积的97.6%（图2和表2），主要成分为四氢熏衣草醇(20.7%)、异次羊脂酸(12.0%)、正二十八烷(11.3%)、4-乙基苯酚(8.7%)、2-甲基丁酸(7.9%)、偏三甲苯(5.8%)、棕榈酸(5.1%)，其余含量均低于5.0%。其中，石油醚相和乙酸乙酯相中均鉴定出4-乙基苯酚和棕榈酸2种成分。

图1 苦荞石油醚相总离子流图

图2 苦荞乙酸乙酯相总离子流图

表1 苦荞石油醚相的化学成分

续表1

表2 苦荞乙酸乙酯相的化学成分

续表2

2.2 苦荞萃取物对马唐和三叶鬼针草种子萌发的影响

苦荞萃取物对马唐和三叶鬼针草种子的萌发均有不同程度的抑制作用，萃取物浓度显著影响马唐和三叶鬼针草的种子萌发（表3）。随着供体萃取物浓度的逐渐升高，对受体种子萌发的抑制作用显著增强。石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相3种萃取物浓度为1.00和2.00 mg/mL时，马唐和三叶鬼针草的萌发率显著高于对照。浓度为2.00 mg/mL时，乙酸乙酯相处理下马唐和三叶鬼针草的发芽率均为0.0%，石油醚相处理下马唐和三叶鬼针草的发芽率与对照相比下降了80.0和56.7个百分点，正丁醇相处理下马唐和三叶鬼针草的发芽率与对照相比下降了60.0和26.7个百分点，均与对照差异显著。3种萃取物对马唐和三叶鬼针草的影响效果因浓度不同而有所差异，低浓度(0.25～0.50 mg/mL)处理下马唐种子萌发率均大于或等于三叶鬼针草，而高浓度(1.00～2.00 mg/mL)处理下马唐种子萌发率均小于三叶鬼针草。结合化感响应指数RI值分析，3种萃取物对马唐和三叶鬼针草发芽率的抑制由强至弱表现为乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相。

表3 苦荞萃取物对2种杂草种子发芽率的影响

2.3 苦荞萃取物对马唐和三叶鬼针草幼苗生长的影响

2.3.1 苦荞萃取物对马唐和三叶鬼针草茎长的影响 研究结果（表4和图3～4）显示，经萃取物处理的种子生长分化后，马唐和三叶鬼针草幼茎长度与萃取物浓度总体上呈负相关，抑制作用为乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相。乙酸乙酯相各浓度处理茎长抑制率均大于石油醚相和正丁醇相（除0.25 mg/mL浓度外），2.00 mg/mL处理浓度下，乙酸乙酯相能完全抑制马唐和三叶鬼针草幼茎的生长，石油醚相的抑制率分别为81.0%和60.0%，而正丁醇相的抑制率仅为49.0%和22.0%。正丁醇相在低浓度(0.25 mg/mL)处理浓度下对马唐的茎长化感响应指数分别为0.10，在0.25～0.50 mg/mL处理浓度下对三叶鬼针草的茎长化感响应指数为分别为0.03和0.05，其余处理均为负值，具有“低促高抑”的现象。相同处理下马唐的茎长化感响应指数均小于三叶鬼针草，说明2种杂草对茎长敏感度马唐要强于三叶鬼针草。

表4 苦荞萃取物对2种杂草幼苗生长化感效应指数的影响

图3 苦荞萃取物对马唐幼茎和幼根生长的影响

图4 苦荞萃取物对三叶鬼针草幼茎和幼根生长的影响

2.3.2 苦荞萃取物对马唐和三叶鬼针草根长的影响研究结果表明，苦荞萃取物处理马唐和三叶鬼针草种子对其幼根长度的影响不同，抑制效果随着浓度的增大而增强。其中乙酸乙酯相抑制效果最明显，浓度大于0.50 mg/mL对2种杂草的抑制率达61.0%以上，2.00 mg/mL浓度处理能完全抑制马唐和三叶鬼针草幼根的生长。同样的，石油醚相也具有较好的抑制效果，2.00 mg/mL浓度处理能完全抑制马唐和三叶鬼针草幼根的生长。正丁醇相效果最差，2.00 mg/mL浓度处理对马唐和三叶鬼针草幼根仅有53.0%和29.0%的抑制率，且在0.25 mg/mL浓度处理下根长化感响应指数分别为0.08和0.06，说明低浓度具有促进幼根生长的作用。从3种萃取物对马唐和三叶鬼针草茎长和根长的化感响应指数对比看，对根长的抑制作用要大于茎长。

3 讨论

3.1 受体植物及评测指标选择优势

化感物质作为植物间的一种重要化学信号物质，作用于植物的不同生长发育阶段而对植物产生影响，如影响种子萌发和植物生长等，最终导致植物种群被抑制[16-17]。因此，利用化感作用可以选择性地对一些恶性杂草进行防控[18]。马唐和三叶鬼针草通常为农田上的主要杂草，三叶鬼针草为入侵性杂草，而马唐则为本地恶性杂草[19-20]。2种杂草通常具有种子数量大、种子萌发率高、生长速度快等特征，因此在杂草群落中容易形成单一群落或成为优势种群，从而对农作物蔬菜、玉米、甘蔗等造成严重的危害[19-20]。本研究表明，苦荞3种萃取物对马唐和三叶鬼针草种子萌发、幼苗根长和茎长均有一定的抑制作用，且随浓度增加而显著增强。种子萌发对植物生长发育至关重要，化感物质对种子萌发的抑制，会降低种子发芽速度，延长出苗时间，严重影响植物对地上和地下资源的竞争能力[21-22]。因此，苦荞的种植可以抑制土壤种子库中马唐和三叶鬼针草种子的萌发和幼苗生长，从而降低其种群密度和危害。

3.2 化感作用响应指数评价

化感作用响应指数用于度量化感作用的类型和强度[15]，其中对受体植物种子萌发、根长和茎长的影响通常是衡量化感作用强度最重要的指标。本研究表明，苦荞不同有机溶剂萃取物对马唐和三叶鬼针草的种子发芽率、根长和茎长的化感响应指数变化趋势基本一致。3种不同萃取物中，乙酸乙酯相的化感作用响应指数最低，即对马唐和三叶鬼针草的化感抑制作用最强，其次是石油醚相，最差的是正丁醇相，这与王力超[23]报道乙酸乙酯萃取物对入侵植物喜旱莲子草幼苗生长的化感抑制作用最强，其次是石油醚萃取物和正丁醇萃取物相一致。3种不同萃取物对马唐的抑制作用大于三叶鬼针草，对根长的抑制明显大于茎长，这与申时才[22]报道的红薯叶片水浸液对马唐和三叶鬼针草的种子萌发和幼苗生长一致。

3.3 苦荞活性物质成分分析

苦荞中含有丰富的生理活性物质，而这些物质往往以次生代谢产物为主，主要包括黄酮类、甾体类、有机酸类、酚类、糖类和脂肪酸类[24-29]等。已有研究表明，有机酸类、酚类和黄酮类物质为化感活性主要物质[29]。本研究中，利用GC-MS分析法分别从石油醚相和乙酸乙酯相中鉴定出24种和19种化学成分，含量均高于0.5%，分别占总出峰面积的98.7%和97.6%。其中石油醚相的主要成分为4-乙基苯酚(26.8%)，乙酸乙酯相的主要成分为四氢熏衣草醇(20.7%)。Janeš等[30]报道苦荞中的香气物质主要是2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)呋喃酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、苯乙醛、2-甲氧基-4-乙烯苯酚等。Kim等[31]报道了苦荞种子中含有绿缘酸、荭草素、异东方蓼黄素、芦丁和槲皮苷等。汪嘉庆等[32]从苦荞中鉴定出乌苏酸、山柰酚、槲皮素、大黄素、糖苷、芦丁等。这些结果与本研究的主要成分差异较大，可能由研究目的、苦荞品种以及提取工艺差异较大所导致。本研究中鉴定出的绝大多数化学成分尚未有相关生物活性的报道，因此需要进一步验证。

4 结论

本研究结果表明，苦荞水提液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇相萃取物对2种杂草马唐和三叶鬼针草的种子萌发和幼苗生长均表现出不同程度的化感抑制作用，活性依次为乙酸乙酯相＞石油醚相＞正丁醇相，且抑制效果与浓度呈正相关。萃取物对马唐的抑制作用总体上大于三叶鬼针草，对根长抑制率大于茎长。利用GC-MS对乙酸乙酯相和石油醚相的化学成分分析表明，乙酸乙酯相和石油醚相中含量大于0.5%的化学成分有41种，其中乙酸乙酯相的主要成分为四氢薰衣草醇、异次羊脂酸、正二十八烷，含量占比分别为20.7%、12.0%、11.3%。石油醚相的主要成分为4-乙基苯酚、5-羟基-6-甲氧基-呋喃并[3,2-g]色烯-7-酮、棕榈酸、4-甲基吲哚，含量占比分别为26.8%、9.5%、9.0%、9.0%。关于各种化学成分的化感活性和化感作用机制有待于进一步研究，以找到植物源除草剂先导化合物，为苦荞大面积的田间替代种植提供理论依据。