农杆菌介导大麦遗传转化的研究进展

危文波

(省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室/西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏 拉萨 850032)

大麦属于禾本科大麦属，具有麸皮的为皮大麦，没有的是裸大麦。当前，大麦育种研究的主要目标是培育优质高产、抗逆性好的大麦品种，而随着分子生物学的快速发展，通过农杆菌介导的方法可以帮助育种工作者快速达成这一目标。

1 大麦遗传转化研究进展

目前，农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法和电击转化法等大麦遗传转化的常用的方法中，农杆菌介导法理论和机理相对清晰，其中根癌农杆菌是农杆菌介导法中运用最多的。农杆菌介导法是将外源基因通过农杆菌侵染导入大麦中，并使外源基因稳定表达遗传的方法。而且在基因转化的研究得到迅速发展之后，再生获得的大麦植株占遗传转化获得的植株的80%[1]。农杆菌介导法具有转基因沉默少、拷贝数量低、遗传稳定等优点，这都是基因枪法不具备的[2]。不同大麦基因型[3]、受体的选择[4]、培养基配方[5]、共培养过程[6]等因素都会影响农杆菌介导的大麦遗传转化。目前，大麦品种“Golden Promise”相比较于其它品种的再生能力更强，也作为大麦遗传转化的主要受体。为诱导幼胚的愈伤组织发生及其持续生长，在FHG基础培养基中添加Dicamba比2，4-D更加明显[5]。早在1997年，Tingay等[3]将大麦品种“Golden Promise”的幼胚作为受体，以农杆菌作为载体，将外源Bar基因和gus基因转入，并收获转化成功的大麦植株54个，但其转化成功率仅有4.2%。

1.1 农杆菌菌株

当前农杆菌介导遗传转化普遍效率较低，是因为菌株活力时常发生变化，影响侵染的有效性；也是由于不同类型植株对农杆菌菌株的侵染能力有较大的差异，因而在实际的操作过程中应当筛选最敏感或最合适的农杆菌菌株[7]。Kazuhito等[8]在1992年报道了应用LBA4404转化成功的例子，并表现出比EHA105更高的转化效率，虽然高毒性农杆菌AGL1要超出LBA4404的转化效率2～3倍，但是该农杆菌的过量生长很大程度地影响了侵染后植株的再生。

1.2 菌液浓度和侵染时间

菌液浓度对转化频率的影响很大，菌液浓度过低，附着于外植体愈伤组织切口处的农杆菌量不够，转化效率降低；菌液浓度过高，外植体诱导的愈伤组织会褐变致死，很难得到抗性愈伤组织。对大多数植物受体来说，侵染效率最高的菌液浓度OD600值是在0.2～0.6范围内[9]。除菌液浓度外，菌液侵染外植体的时长也会对转化的结果产生影响。附着于外植体诱导产生的愈伤组织切口的农杆菌数量会随着侵染外植体时长的增加而增加，侵染时间过短，农杆菌菌液数量过少，不足于侵染愈伤组织；侵染时间过长，菌液长时间浸泡造成伤害。两种情况都不利于外源基因的遗传转化，因此筛选合适的侵染时间会直接影响到大麦的遗传转化效率[10]。

1.3 共培养时间

研究表明，在附着外植体后农杆菌并不立即转化，而是在经过约16h的“细胞调节期”之后才会发生T-DNA的转移[2]。通过Shrawat等[6]的研究表明，农杆菌侵染大麦后条件20～25℃温度环境下共培养2～3d，可使转化效率达到最佳。可见，转化效率是受到共培养时间的影响，而且不同植株的外植体，相同农杆菌的最佳共培养时间也是不同的。

2 应用

农杆菌介导法转化功能基因为大麦品质的改良提供了技术支撑，其中包括大麦的抗逆性特别是非生物胁迫耐受性、籽粒产量以及大麦的麦芽和营养品质等。

2.1 非生物胁迫耐性

在植株的生长过程中，外界不同程度的光、温、水、气等气候条件和营养条件都会产生有利或不利的影响，而植株本身就含有可以减少或降低非生物胁迫的基因。如何有效地发现并利用这些功能基因，改善大麦植株的进化周期和适应过程，也是农作物育种者的努力方向。

2.1.1 金属离子耐受性

小麦品种“Triticumaestivum”对高浓度铝离子的耐受性特别强，通过研究发现，是ALMT1的基因在发挥作用。Delhaize等[11]在大麦品种“Golden Promise”中转入该基因，其转化植株表现出类似小麦品种的基因表达量且稳定，在铝离子较高的水培和酸性很强的土壤中均表现良好。

2.1.2 抗旱性与抗寒性

小麦的2个CBF/DREB转录因子持续过量表达也控制多种胁迫应答基因的活性。Morran等[12]将小麦的TaDREB2和TaDREB3 2个转录因子通过农杆菌介导遗传转化法导入大麦植株内，转化植株体内外源基因的持续过量表达减缓了其生长发育，影响其受粉，导致产量下降；但是在严重缺水情况下，TaDREB2和TaDREB3的转化植株比非转化植株的对照的生存状态更好。定量PCR检测结果表明，提高转化大麦植株中TaDREB2和TaDREB3表达量，可以增加CBF/DREB基因以及LEA/COR/DHN的表达，从而有效改善转化植株的抗旱性和抗寒性。

2.2 籽粒产量

细胞激动素是一种植物激素，其在各个组织器官中的活性受到细胞激动素脱氢酶(CKX)的调节。Zalewski等[13]通过农杆菌介导法将含HvCKX1部分编码基因的干涉载体转入大麦品种“Golden Promise”，以RNAi的方式降低了CKX1的表达。与野生型比较，转基因大麦T0株系根部CKX1活性明显降低，产生的种子数量和千粒重显著增加，提高了作物的产量，为通过基因水平调控CKX达到增产目的提供了潜在的可能性。

2.3 麦芽品质

啤酒酿造的基础材料是麦芽，如何利用外源功能基因去改良麦芽的品质一直是啤酒大麦育种工作者的追求。在大麦啤酒的酿造过程中，如何有效控制影响酿造效率的因素，包括有可发酵糖类的数量、麦芽汁粘的稠度和过滤状况、细胞壁和淀粉的水解的淀粉酶和葡聚糖酶的数量等都影响着麦芽的品质。刘雷[14]等2005年向大麦幼胚中导入TrxS基因，获得了T0代转基因植株49株,PCR检测结果显示，目的基因已成功转入，T2代转基因植株检测结果表明，该大麦植株基因组完整遗传TrxS基因。通过测定发芽种子中淀粉酶的活性发现，对比野生型植株，转基因植株的α-淀粉酶活力高出0.63倍，β-淀粉酶活力则高出11.1ug·min-1。

2.4 营养品质

大麦在土壤中吸收到的锌元素的数量影响其最终的产量和营养品质，而锌元素运输载体AtZIP1基因影响着锌元素的摄取速度。Ramesh等[15]以大麦品种Golden Promise为受体，利用农杆菌将拟南芥中该外源功能基因转入其中，并使其过量表达，实验结果表明，在相同条件下的土壤中，遗传转化的大麦植株籽粒不管是锌元素、镁元素以及铁元素的总含量，还是每粒种子中的平均含量均比正常大麦中的含量更高。微量元素的含量一定程度上影响着作物的营养品质，而调控摄取微量元素的机制，农杆菌介导法为其提供了途径和方法。

尽管大麦遗传转化研究进展迅猛，特别是青稞全基因组测序的完成和转化品种的不断扩大，但还是有很多问题限制其发展，包括转化完成后不同大麦品种的再生体系不尽相同，转化植株体内外源基因表达的稳定性和组织特异性，以及要考虑和研究遗传转化大麦的环境与生物安全性等[16]。在解决了这些限制因素后，相信在功能基因的挖掘、生理机制等基础领域的研究和食品以及育种等生产领域的研究，农杆菌介导的遗传转化有着更加亮眼的未来。