病毒样颗粒疫苗的研究进展

谭 坤，张丽琳

（天津大学生命科学学院，天津300072）

病毒样颗粒（VLPs）是由病毒的结构蛋白组装形成的，与自然病毒结构相似的一类蛋白粒子，具有良好的生物活性和与病毒相同的免疫原性，是疫苗制备的良好选择。疫苗一直是控制和预防传染病最有效的方法之一。

传统的疫苗主要是减毒疫苗和灭活疫苗，这些疫苗可以很好地激发机体的免疫反应，抵御疾病的传播［1］，但是这些传统疫苗也有一些明显的缺陷，比如其安全性以及制作的困难性制约了疫苗在某些疾病上的使用。20世纪80年代以来，VLPs逐渐替代传统疫苗成为疫苗制备的首选［2］。VLPs是一种多蛋白分子，大部分由几个相同的蛋白质组成二十面体或螺旋结构，在与活病毒结构相似的同时缺失病毒的基因组，因此十分安全。迄今为止，已有多种VLPs疫苗实现商业化，证明是一种已经被大家承认的安全有效的疫苗。

1 VLPs疫苗的分类

根据原始病毒的结构，VLPs疫苗可以分为有包膜和无包膜两类。无包膜的VLPs疫苗只包含由病毒的蛋白形成的颗粒［1］，如诺瓦克病毒和戊型肝炎病毒。有包膜的病毒除了病毒本身的蛋白外，还包含宿主的细胞膜［3］，比如A型流感病毒和乙型肝炎病毒［4，5］。

根据制备的VLPs疫苗的结构，可以将VLPs疫苗分为四类：VLPs疫苗、嵌合VLPs疫苗、VLPs交联疫苗以及VLPs冲击的树突状细胞（DCs）疫苗。VLPs疫苗是最简单的VLPs疫苗，它利用了病毒蛋白组装形成与病毒结构相似的颗粒，激起机体的免疫反应，达到预防疾病的效果。嵌合VLPs疫苗是在VLPs疫苗的基础上，在VLPs的外部连接一些关键的抗原蛋白，从而提高疫苗的免疫原性［6］。但是嵌合VLPs疫苗的成功表达和组装是一个需要耐心探究的过程，同时还需要限制插入蛋白的大小。VLPs交联疫苗也是将外来抗原连接到VLPs外部，方法是将一个或多个赖氨酸添加到VLPs的免疫反应区，同时将半胱氨酸添加到外来抗原上，然后利用化学交联剂把外来抗原连接到VLPs表面［7］。VLPs冲击的树突状细胞（DCs）疫苗利用机体特异性产生的树突状细胞，将树突状细胞与VLPs结合，使疫苗具有很好的靶向性和免疫治疗效果［7］。

根据VLPs疫苗的功效，可以将VLPs疫苗分为预防型疫苗和治疗型疫苗两类。

2 VLPs疫苗的优势

从20世纪80年代以来，VLPs逐渐成为了一种安全有效的疫苗。VLPs是由病毒蛋白组成的具有和病毒结构十分相似结构的粒子，包含病毒的很多特征，因此可以很好地用于疫苗的开发。VLPs可以形成独特的重复表面结构，这种刚性的重复表面结构是一种强有力的促进B细胞交联的几何结构，可以很大地激起机体的免疫反应［8，9］。体液免疫过程中包含很多多聚体，促进了与VLPs的结合，从而提高了抗原提呈细胞对VLPs的定位和摄取［10］，增强了免疫系统的适应性［11］。因此，VLPs作为疫苗具有很多传统疫苗的特点，同时本身并不具有病毒核酸，不会在机体内复制，提高了疫苗的安全性［10］。VLPs疫苗的研发时间较传统疫苗相比时间较短，可以迅速应对流行病的爆发。目前，有很多VLPs疫苗已经商品化，包括乙型病毒肝炎疫苗［12］、人乳头瘤病毒疫苗［13］以及戊型肝炎病毒疫苗［14］等，证明VIPs疫苗具有很好的免疫性和安全性。

3 VLPs疫苗的表达系统

VLPs的表达系统有很多，总计有170多种，常用的是5种表达系统：细菌表达系统，使用率为28%；昆虫表达系统，使用率为28%；酵母表达系统，使用率为20%；哺乳动物细胞表达系统，使用率为15%；植物表达系统，使用率为9%。不同表达系统的优缺点比较见表1。

表1 不同表达系统的比较

3.1 细菌表达系统

细菌表达系统是VLPs表达过程中最常用的表达系统。在利用细菌表达系统制备VLPs时，可以将病毒的结构蛋白基因优化为细菌喜好的密码子，同时将病毒基因插入到具有强启动子的载体上，从而显著增加外源蛋白的表达量［15，16］。作为目前使用最广泛的表达系统之一，细菌的遗传背景清晰，可以适应不同的载体和宿主菌，同时它又具有繁殖速度快、培养价格低、产量高等优点。但是细菌表达系统的缺点也很明显，细菌缺乏转录后剪切、翻译后修饰的能力，在VLPs表达方面具有一定的局限性［17］。目前用细菌表达的VLPs疫苗有人乳头瘤病毒疫苗和豇豆褪绿斑驳病毒疫苗等。

3.2 昆虫表达系统

昆虫表达系统利用杆状病毒作为穿梭载体，通过转座作用将表达所需的元件连接到载体上，然后将载体转染昆虫细胞，得到包含外源蛋白完整转录单位载体的重组病毒。然后用病毒感染细胞，培养后即可获得重组蛋白。昆虫表达系统可以进行良好的翻译后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等，从而让蛋白进行正确的折叠，使重组蛋白的结构和功能与天然蛋白更加相似，同时表达大分子量的外源蛋白（0~200 kDa）也是昆虫表达系统的一项优点。但是昆虫表达系统也有细胞生长缓慢、培养基昂贵以及病毒感染会导致宿主死亡等缺点［18］。HPV的双价VLPs疫苗以及蓝舌病病毒疫苗都是用昆虫杆状病毒系统表达生产的。

3.3 酵母表达系统

酵母表达系统是一种常用的表达系统，相较于原核生物表达系统，酵母表达系统可以进行较好的转录翻译后的修饰，使表达的蛋白更加接近于天然蛋白，同时它又具有原核生物生长速度快、培养简单和价格低廉的优点，是一种普遍使用的真核表达系统［19］。酵母的种类有很多，毕赤酵母和酿酒酵母是常用的两种。毕赤酵母具有强启动子——AOX［20］，利用甲醇进行诱导可以明显提高外源基因的表达。酿酒酵母用于食品加工已经有悠久历史，因此十分安全可靠。同时，酿酒酵母进行了全基因组测序，遗传背景清晰，方便遗传操作［21，22］。目前，市面上销售的HPV九价疫苗就是利用酿酒酵母表达生产的。

3.4 哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统可以准确且复杂地转录翻译后修饰，使组装的VLPs的分子结构、理化特性和生物功能与天然病毒蛋白最接近，能够保证免疫原性。但是，哺乳动物细胞培养条件复杂、价格昂贵以及表达量较低等缺点也制约其在工业上的应用［23］。中国长春生物制品所利用哺乳动物细胞制备的乙肝疫苗已经投入生产，具有良好的效果。利用哺乳动物细胞表达系统生产的VLPs可以准确进行复杂的转录翻译后修饰，使表达产物在分子结构、理化特性和生物功能上最接近天然病毒蛋白，具有很好的免疫原性。但是哺乳动物细胞培养条件复杂、价格昂贵以及表达量较低等缺点也制约其在工业上的应用［23］。

3.5 植物表达系统

植物表达系统主要利用植物病毒载体和农杆菌将要表达的基因转染到植物细胞内，使其大量表达外源蛋白［24］。最先利用植物表达系统研制的疫苗主要是口服疫苗，后来开始转向注射疫苗，使疫苗的生产使用更加准确［25］。在转基因植物中，VLPs疫苗研究较好的是诺瓦克病毒疫苗［20］。

4 VLPs疫苗的纯化与组装

病毒样颗粒的纯化主要包括4个步骤，分别是裂解、粗提、浓缩和精制［26］。在制备VLPs的过程中，需要在保证质量的同时，选择简单高效的方法。

裂解：在进行蛋白表达的时候，很多时候在蛋白的前端添加信号肽，将蛋白分泌到细胞外。但是在某些情况下，组装VLPs的蛋白无法分泌到胞外，纯化这类的VLPs就需要进行细胞裂解［27］。处理不同的细胞会选择不同的方法，对于哺乳动物和昆虫细胞来说，去污剂处理是细胞裂解最常用的方法，而高压、超声、研磨以及冻融等方法［28，29］则多用于细菌、酵母和植物细胞。在这个过程中，最重要的是防止蛋白降解，所以需要根据蛋白特性配置不同的缓冲液，并在其中加入蛋白酶抑制剂和蛋白稳定剂［30］。

粗提：裂解细胞之后进行粗提，在这一步将细胞碎片和大聚合物去掉［31］。离心是蛋白粗提过程中常用的方法，一般使用低速离心机或者连续流离心机［27］。连续流离心机的分离效果比较好，而且可以将细胞裂解液连续导入，方便快捷。另外使用0.45 μm的滤膜也可以有效去除细胞碎片，达到粗提的效果。

浓缩：浓缩在粗提之后，主要的目的是去除杂蛋白和提高目的蛋白浓度。浓缩的方法有很多，包括硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、蔗糖氯化铯梯度超速离心、离子交换层析等［32］。近些年来，利用Monoliths制作的离子交换柱、疏水层析柱或亲和层析柱也成为浓缩蛋白的良好工具［27］。

精制：当VLPs应用于临床时，浓缩后的VLPs需要精制。精制的主要目的是去除表达系统宿主本身的蛋白质和DNA，同时去除纯化相关杂物。精制主要采取离子交换层析、膜装置和分子排阻等方法。

经过纯化处理后，对于表达的单体蛋白还需要进行正确的组装，不完全或者不规则的组装会导致VLPs疫苗效果的下降，因此，需要对VLPs进行去组装和重组装处理，以提高VLPs的稳定性、均一性和免疫原性［33］。不同的VLPs需要不同的缓冲液进行去组装和重组装，需要不断地研究与探索。HPV16 L1 VLPs的去组装需要在高pH、低盐和还原剂的溶液下进行，重组装需要在低pH、高盐和去还原剂的条件下进行［31］。

5 病毒样颗粒的鉴定

在制备VLPs的过程中，要对VLPs的制备情况进行检测，因此必须要有良好的检测与鉴定VLPs的方法。检测VLPs主要通过4个方面：性质、含量、效果和纯度。

性质：VLPs性质的检测主要包括VLPs的形态、大小、氨基酸序列、相对分子质量、降解修饰情况、中和表位、抗原特异性等方面［34］。性质检测的方法有很多，比如SDS/PAGE法、Western Blot法、ELISA法、表面等离子体共振技术、投射电子显微镜法、免疫电镜法、蛋白质测序法、质谱法等。

含量：含量是VLPs检测中很重要的一步，关系到VLPs疫苗使时的用量。主要的方法有ELISA法、BCA法、Bradford法、紫外分光光度法等。

效力：VLPs的效力检测是证明VLPs疫苗效果的关键。主要包括体外试验，如血凝抑制试验；体内试验，如免疫试验、攻毒试验等。

纯度：VLPs纯度是检测纯化和精制效果的关键，同时也与能否用于临床试验相关。纯度检测主要检测VLPs结构蛋白的纯度、VLPs的组装率、宿主DNA和蛋白的残余、蛋白核酸复合物的多少等。主要的方法有ELISA法、SDS/PAGE法、DNA染色方法、琼脂糖凝胶电泳迟滞试验、透射电镜检测法等［30］。

使用透射电镜观察VLPs是检测VLPs大小、形态和分布最快捷、最有效的方法，在投射电镜下可以很清晰地看到VLPs的形态与大小，并可以通过形态和大小推测VLPs的效力［35］。VLPs的效力主要通过3个试验证明：体外中和抗体结合试验，检测VLPs的抗原性；病毒中和试验，检测VLPs诱导产生抗体的病毒中和活性；动物免疫试验，检测血清中的抗体和抵御病毒的能力［34］。

6 VLPs疫苗激发的免疫通路

VLPs的大小在20~200 nm，因此可以很自由地通过存在200 nm大小孔壁的淋巴管，在淋巴系统内穿梭。最新的研究显示，在小鼠脚垫部位注射20~30 nm的VLPs，10 min内可以在淋巴细胞内检测到积累［36］。一般来说，VLPs进入细胞通过两步：首先通过内皮细胞壁的血管孔自由扩散到淋巴细胞内，然后通过被动运输进入淋巴结的被膜下窦［37］。

VLPs的表面排列着大量重复的抗原表位，因此可以很好地激起机体的免疫反应。VLPs在进入机体后，凭借与病原体分子的相似结构，可以被宿主的模式受体识别（Toll样受体）并且被抗原提呈细胞捕获［38］，然后通过MCHⅠ类分子通路交叉呈递活化CD8+T细胞。VLPs也可以作为外源性抗原被树突状细胞识别，然后通过MCHⅡ类分子呈递，直接促进树突状细胞的迁移与成熟，刺激先天性免疫反应，刺激免疫模式与原病毒相同［39-42］。活病毒在感染机体后在树突状细胞内繁殖时，会表达一些特定的蛋白阻止细胞的活化和成熟，而VLPs可以很好地避免这一问题［43］。

7 VLPs疫苗的修饰

为了使疫苗可以有效地诱导抗体反应，在设计疫苗时应考虑以下几点：①疫苗的目标抗原要以真实自然的状态呈递给B细胞［44］。②设计的疫苗可以有效地通过B细胞受体成功激活B细胞［45，46］。③疫苗可以使用不同的Toll样受体装配VLPs，作为佐剂来增强机体免疫反应［47-49］。这些设计都可以通过不同的修饰方法实现。

化学修饰技术主要是通过化学方法修饰VLPs表面的氨基、羧基、磺酰基以及羟基，其中赖氨酸残基是VLPs表面最常用的修饰靶点，主要通过将N-羟基琥珀酰亚胺脂与游离的赖氨酸反应形成稳定的酰胺键，在VLPs表面连接其他抗原蛋白。肼连接化学［50］和点击化学［51］是2种常用的修饰表面氨基酸的方法。点击化学以及最近开发的无铜点击化学已经广泛用于VLPs修饰，比如VLPs与肿瘤相关抗原的偶联［52-54］。在工业上VLPs化学修饰主要通过双功能交联剂实现，可以在VLPs表面连接任何抗原。比如通过碳亚二胺可以将豇豆花叶病毒表面的180个羧基盐与抗癌药阿霉素偶联［55］。

当连接抗原特别大时，化学修饰就不能使用了，这时可以利用基因修饰的方法来改变VLPs的结构。基因修饰的主要原理是引入外源多肽和抗原，分为直接引用和通过改造基因组引入。高免疫原性的乙型肝炎核心抗原就是利用了基因修饰加入了特定序列，从而提高了疫苗的免疫效果［56］。这项技术最开始的时候用于在表达蛋白的末端加入短肽，最近已经发展为可以在其他部位加入长的肽段。这主要利用了分离蛋白核心的技术，在特定的部位人为加入终止子和启动子，使蛋白分离成为多个不同的核心，从而在核心之间插入抗原，这项技术可以表达300个氨基酸以上的偶联蛋白［57，58］。另一种相似的方法称为串联核技术，在已经稳定组装连接的VLPs中加入主要免疫核心［59］。最后一种基因修饰技术是在VLPs中插入或突变氨基酸，可以提高在表达宿主中的稳定性和表达效率。将烟草马赛克病毒衣壳蛋白中的天冬氨酸和谷氨酸突变为天冬酰胺和谷氨酰胺，可以提高蛋白在宿主细胞内的组装能力［60］。

病毒颗粒的内部本来是病毒的核酸，在表达病毒蛋白组装成VLPs时，其内部的核酸被去除，提高了疫苗的安全性。后来发现，可以通过在VLPs的内部加入相应的佐剂，从而提高疫苗的免疫效果。在VLPs内部加入的大部分是激活树突状细胞的佐剂，包括dsRNA、ssRNA和非甲基化CPGs，分别激活TLR3、TLR7/8和TLR9。将这些佐剂包裹到VLP中，可以很好地将佐剂运输到抗原提呈细胞，然后VLPs的蛋白外壳被降解，Toll样配体释放刺激相应受体［8，61］。

8 VLPs疫苗的研发

8.1 乙型肝炎（HBV）VLP疫苗

乙型肝炎的VLP疫苗已经研发了3代，是一款比较成熟的疫苗。1965年巴鲁克·布隆伯格从乙肝感染者血液中分离出来抗原性物质Aa，这一发现，使得乙肝疫苗的研制成为可能［62］。第一代疫苗出现于20世纪80年代，第二代疫苗利用酿酒酵母表达乙肝病毒的SHBs小蛋白制备，它为母体感染乙肝病毒的新生儿提供了有效的保护，并在世界范围内显著降低了乙肝病毒的感染率［63］。最近，基于乙型肝炎表面抗原的第三代疫苗已经在以色列以及其他14个东亚国家使用，在30万人中显示了很好的安全性和有效性，它在免疫低下的老年人和肾衰竭的人群中具有更好的效果。它利用了中国仓鼠卵巢细胞表达的S、Pre-S1和Pre-S2 3种乙型肝炎表面抗原组装而成。该疫苗可以在2.5~10.0 μg范围剂量下诱导产生高滴度的抗体，有人认为可以作为治疗性疫苗用于慢性乙型肝炎病毒感染。

8.2 人乳头瘤病毒（HPV）VLP疫苗

2006年，第一个HPV VLP疫 苗Gardasil®在美国批准使用，它由6、11、16、18型HPV病毒的主要衣壳蛋白L1和中性盐羟基铝硫酸磷酸盐佐剂组成。到2014年，Gardasil®已经被覆盖范围更广的Garda⁃sil9®替代，它增加了31、33、45、52和58型的HPV病毒蛋白，研究表明，20%的宫颈癌是由这些新增加的HPV病毒感染引起的［63］。

9 展望

利用VLPs开发疫苗是近些年来迅速发展的一门学科，它结合了免疫学、微生物学、病毒学和疫苗学的相关知识，已经成为制备疫苗的热门选择。VLPs以其简单、稳定、安全以及独特的结构吸引着众多科学家的目光。在当今的研究中，VLPs已经不仅单纯作为疫苗而使用，更成为疫苗研究以及更多研究的优秀工具。随着对VLPs研究的加深，VLPs将会给疫苗研发带来更多的机遇。