冷冻切片组织速冻方法改良

陈 志，朱卫东，郭凌川

冷冻切片制作是将新鲜的病变组织与OCT包埋剂在低温环境下快速冷冻后切成薄片的过程。冷冻切片制作流程简便、迅速，有助于外科医师判断病变的良恶性，及时决定手术方式。准确的病理诊断结果依赖优质、高效的冷冻切片制作，影响冷冻切片质量的因素较多，如取材、温度、切片、染色等，而冷冻时间是影响制片优劣的重要因素之一[1]。本实验通过比较两种不同冷冻方法的制片速度和质量，发现一种方便易行的组织速冻方法，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集苏州大学附属第一医院手术室送检的行术中快速冷冻病理检查标本50例，其中乳腺8例，肺12例，甲状腺12例，子宫肌瘤10例，前哨淋巴结8例。

1.2 仪器与试剂ThermoFisherNX50冷冻切片机，Olympus BX31光学显微镜，95%乙醇固定液，Gill苏木精，0.25%醇溶性伊红，无水乙醇，中性树胶等。

1.3 方法将50例标本平均分为2组，每组含乳腺4例，肺6例，甲状腺6例，子宫肌瘤5例，前哨淋巴结4例。采用两种方法制片：(1)冷冻台冷冻法：将组织放入组织托上添加适量的OCT包埋剂，置于冷冻切片机冷冻台上进行冷冻。(2)改良冷冻法：将组织放入组织托，加入OCT包埋剂。在冷冻切片机冷冻台凹槽里加少许无水乙醇，使其铺满凹槽底部，再将组织托放入冷冻凹槽进行速冻。组织冷冻后行常规冷冻切片、HE染色、中性树胶封固。

1.4 结果判定HE切片根据切片完整度、组织结构、细胞形态、染色强度、染色对比度、有无空泡、冰晶、裂隙等因素进行评分。冷冻切片质量评分等级标准：满分为100分，90分以上为甲级片，80～89分为乙级片，60～79分为丙级片，60分以下为丁级片。所有切片均经两位主治医师独立判断评分。

2 结果

2.1 两种冷冻方法的冷冻时间对比冷冻时间以组织托放入冷冻槽内开始计时，以组织及周围OCT包埋剂完全凝固为结束时间，分别记录每个组织样本的冷冻时间。单因素方差分析的方差齐性检验表明本组实验不适用于单因素方差分析，遂改用非参数Wilcoxon秩和检验，结果表明改良冷冻法的组织冷冻时间明显低于冷冻台冷冻法，差异有显著性(P<0.001，表1)。

表1 两种冷冻方法的组织冷冻时间

2.2 两种冷冻方法的制片质量对比将所有切片评分后根据组织类型分类，比较两种方法的区别。单因素方差分析结果表明，改良冷冻法处理乳腺、肺、甲状腺、子宫肌瘤、前哨淋巴结的得分均高于冷冻台冷冻法，差异有显著性(P均<0.05，表2)。

表2 两种冷冻方法的制片质量评分

镜下观察两种方法制片行HE染色后冰晶出现情况，镜下发现经冷冻台冷冻法处理的组织内形成大量冰晶，细胞核受挤压，有空洞，细胞间有不规则裂隙，组织结构形态变化明显；经改良冷冻法处理的组织中冰晶较少，组织结构完整，无空洞、裂隙，染色均匀(图1、2)。

图1 冷冻台冷冻法：A.甲状腺；B.子宫肌瘤；C.前哨淋巴结 图2 改良冷冻法：A.甲状腺；B.子宫肌瘤；C.前哨淋巴结

2.3 两种冷冻方法的报告时间对比记录每个标本从接受到报告签发的时间。改良冷冻法的平均报告时间为21.3 min，冷冻台冷冻法的平均报告时间为33.6 min。冷冻台冷冻法的报告超时率为40%(10/25)，改良冷冻法的报告超时率为4%(1/25)。Wilcoxon秩和检验结果分析显示，改良冷冻法的平均报告时间明显低于冷冻台冷冻法，差异有显著性(P<0.001，表3)。

表3 两种冷冻方法的报告时间

3 讨论

冷冻速度是冷冻切片成败的关键。冷冻速度慢、时间长导致组织内产生大量冰晶[2]。组织在缓慢冷冻的过程中细胞内外的水分子逐渐凝结，形成较大的冰晶颗粒，从而挤压细胞核或使细胞间隙增大，待切片染色时冰晶融化留下大量的空泡、空核，组织形态上也会出现间隙增大，组织结构改变等假象，严重影响病理诊断的准确性[3]。

在较短的时间内达到组织所需的冷冻温度，是减少冰晶生成的有效方法[4]。传统的冷冻台冷冻法利用组织托的传导性将低温从冷冻台传导到组织上，与以下因素有关：(1)组织托与冷冻台并非完全贴合。(2)低温传导方向自下而上，越往组织表面传导速度越慢。改良冷冻法在组织托和冷冻台凹槽之间加入无水乙醇作为传导媒介，增大了组织托与冷冻台的接触面积。此外，无水乙醇的冰点为-114 ℃，低温下不会凝结且有良好的冷传导效率，因而能加速组织的冷冻，明显缩短冷冻时间，最大程度的减少冰晶的产生。在组织底部基本凝固，表面少许OCT尚未凝固时，可放置冷冻锤于组织表面，加速表面组织的冷冻，进一步缩短冷冻时间[5]。另外，取材时应避免用水冲洗标本，组织血水较多时需用纱布吸去表面的水分，也可减少冰晶的产生。

综上所述，改良冷冻法可以有效地减少冰晶的产生，值得临床应用和推广。制作出高质量的冷冻切片是病理技术人员不断追求的目标。一张高质量的冷冻切片除考虑冷冻时间外还需考虑多方面因素，如取材大小、厚度、切片技术、染色流程等[6]。只有在工作中不断地探索、学习、改进，才能使技术水平不断地提高。