胃癌中PDLIM5的表达及临床意义

张邢松，沈 蓉，缪小兵

胃癌是一种多分子和组织学亚型的异质性疾病[1]。2014年，癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)将胃癌分为EBV阳性型、微卫星不稳定型(microsatellite instability, MSI)、基因组稳定型以及染色体不稳定型4种亚型[2]。骨架蛋白PDLIM5(PDZ and LIM domain 5) 也称ENH，是PDZ-LIM结构域蛋白家族成员，最初被鉴定为PKC激酶结合蛋白。除PKC外，PDLIM5还可以结合多种蛋白激酶，包括PKD、AMPK以及PKA。PDLIM5包含1个PDZ以及3个介导蛋白质间相互作用的LIM结构域[3]。作为肌动蛋白衔接蛋白，PDLIM5不仅参与细胞骨架形成和器官的发育，还在多种肿瘤的发生、发展中发挥作用。据报道，PDLIM5在多种肿瘤中表达上调，如非小细胞肺癌、甲状腺乳头状癌、前列腺癌[3-5]。PDLIM5在胃癌中表达的研究甚少。本实验采用免疫组化法并结合在线数据库，分析PDLIM5在胃癌中表达的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2013年～2015年江苏省南通市肿瘤医院病理科确诊的胃癌患者212例。所有患者术前均未行放、化疗或靶向治疗。患者年龄27～82岁，中位年龄66岁。男性165例，女性47例。按Lauren分型：肠型99例、弥漫型78例、混合型35例。按pT分期：pT1 29例、pT2 24例、pT3 71例、pT4 88例。按pN分期：pN0 64例、pN1/N2/N3 148例。无脉管侵犯134例，有脉管侵犯78例。无神经侵犯124例，有神经侵犯88例。pTNM分期：Ⅰ期35例、Ⅱ期60例、Ⅲ期117例。肿瘤直径≤4 cm 110例、>4 cm 102例。错配修复缺陷型(deficient mismatch repair, dMMR)43例、错配修复正常型(proficient mismatch repair, pMMR)169例。EBV编码的小RNA(Epstein-Barr virus-encoded small RNA, EBER)阳性7例，阴性205例。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 PDLIM5一抗(稀释度1 ∶200)购自Abcam公司；一抗MLH1(克隆号ES05，稀释度1 ∶100)、MSH2(克隆号RED2，稀释度1 ∶100)、MSH6(克隆号EP49，稀释度1 ∶600)以及PMS2(克隆号EP51，稀释度1 ∶100)均购自北京中杉金桥公司，二抗及DAB试剂购自丹麦Dako公司。免疫组化染色采用EnVision法，染色步骤按试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

1.2.2原位杂交(in situ hybridization, ISH) 按北京中杉金桥公司EBER原位杂交试剂盒(ISH-5021)说明书进行。以EBER阳性的鼻咽癌组织作为阳性对照，以杂交液作为阴性对照。EBER阳性信号定位于细胞核，呈棕黄色。

1.3 免疫组化结果判读PDLIM5评分采用H-score法。参考Chen等[6]的标准，按着色强度评分：无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分。H-score=3×棕色细胞百分数+2×棕黄色细胞百分数+1×黄色细胞百分数。H-score范围0～300。以中间值为截点，将H-score<150定义为PDLIM5低表达，将H-score≥150定义为PDLIM5高表达。MLH1、MSH2、MSH6以及PMS2四种错配修复蛋白均定位于细胞核，核呈黄色、棕黄色或棕色判定为阳性，阳性细胞数<10%判定为表达缺失。

1.4 Kaplan-Meier Plotter数据分析在Kaplan-Meier Plotter数据分析平台中检索PDLIM5基因，应用在线分析软件绘制生存曲线。

1.5 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。应用Pearson χ2或Fisher精确概率检验分析PDLIM5表达与胃癌临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier法绘制患者生存曲线，生存曲线的比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDLIM5表达与胃癌临床病理特征的关系PDLIM5表达定位于细胞膜/质。212例胃癌中，PDLIM5高表达173例，低表达39例。PDLIM5在胃癌组织(H-socre 196.3±4.886)中的表达显著高于癌旁胃黏膜组织(H-socre 148.7±4.628)(P<0.000 1，图1)。PDLIM5表达与患者性别、年龄、Lauren分型、pT分期、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结转移、pTNM分期、肿瘤直径及EBER表达无关(P均>0.05)；PDLIM5表达与错配修复蛋白(MLH1、MSH2、MSH6及PMS2)的表达相关：其在pMMR患者中的表达高于dMMR患者(P=0.007，表1，图2、3)。

图1 A.PDLIM5在胃癌组织中高表达；B.PDLIM5在对应癌旁胃黏膜组织中低表达，EnVision法 图2 A.错配修复正常型胃癌中MLH1阳性；B.错配修复正常型胃癌中MSH2阳性；C.错配修复正常型胃癌中MSH6阳性；D.错配修复正常型胃癌中PMS2阳性，EnVision法 图3 错配修复正常型胃癌中PDLIM5高表达，EnVision法

表1 胃癌中PDLIM5表达与临床病理特征的关系

2.2 PDLIM5表达与胃癌患者预后的关系本组对Kaplan-Meier Plotter数据库中PDLIM5 mRNA的表达进行挖掘，发现了9个相关基因芯片数据，分别为Affymetrix ID：203242_s_at、203243_s_at、211680_at、211681_s_at、212412_at、213684_s_at、216803_at、216804_s_at、221994_at，其中7个基因芯片数据(203242_s_at、211680_at、211681_s_at、213684_s_at、216803_at、216804_s_at、221994_at)显示：PDLIM5 mRNA高表达患者较低表达患者的总生存期(overall survival, OS)明显缩短(P均<0.05)。对212例胃癌患者进行生存分析发现，PDLIM5蛋白表达与患者OS无明显相关性(P=0.761，图4)。

图4 Kaplan-Meier生存曲线分析PDLIM5蛋白表达与患者预后的关系

3 讨论

PDLIM5是由Kuroda等[7]于1996年以蛋白激酶C为诱饵蛋白通过酵母双杂交技术首次鉴定发现。PDLIM5基因位于人染色体4q22.3，由一个N端的PDZ结构域和3个C端的LIM结构域组成，编码相对分子质量为6.3×104的细胞质蛋白。PDLIM5可通过其PDZ结构域与细胞骨架和膜蛋白结合，并通过其LIM结构域与各种信号分子(包括蛋白激酶和转录因子)相互作用。PDLIM5在调节细胞增殖、分化和细胞命运中起重要作用。在中枢神经元中，PDLIM5主要定位于细胞膜及细胞质，于细胞膜/质中调节神经元钙信号传导，并与神经递质突触囊泡共定位。有研究发现，PDLIM5表达异常与多种精神障碍有关[8]。PDLIM5在骨骼肌和心肌中高表达[9]。有研究发现，PDLIM5可通过PDZ结构域与α-肌动蛋白结合，从而在心脏发育中起作用[10]。

有研究报道，PDLIM5在非小细胞癌[3]及前列腺癌[5]组织中的表达高于癌旁组织。与上述研究相似，本实验结果证实PDLIM5在胃癌组织(H-socre 196.3±4.886)中的表达显著高于癌旁胃黏膜组织(H-socre 148.7±4.628)(P<0.000 1)。Liu等[5]研究发现，在前列腺癌中PDLIM5高表达与高Gleason评分、高PSA水平以及转移相关。本实验发现，PDLIM5在pMMR患者中的表达高于dMMR患者(P=0.007)；但PDLIM5表达与患者性别、年龄、Lauren分型、pT分期、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结转移、pTNM分期、肿瘤直径及EBER表达无关(P均>0.05)。据报道，在非小细胞癌[3]、前列腺癌[5]以及甲状腺乳头状癌[4]中PDLIM5高表达可促进肿瘤细胞的迁移、侵袭。在非小细胞癌中PDLIM5通过增强SMAD3的稳定性促进TGFβ信号传导；而敲低PDLIM5可抑制TGFβ诱导的上皮-间质转化[3]。在DU145以及PC-3前列腺癌细胞中，PDLIM5可通过与AMPK直接相互作用抑制AMPK的降解，促进AMPK活化，敲低PDLIM5可通过诱导细胞周期G2/M期停滞和细胞凋亡抑制肿瘤细胞的增殖和克隆形成[5]。Xie等[11]研究发现，敲低lncRNA AGAP2-AS1还可通过调节miR-195-5p依赖PDLIM5的下调继而抑制前列腺癌的发展。在甲状腺乳头状癌中，PDLIM5通过活化Ras-ERK信号通路促进甲状腺乳头状癌的发展[4]。

Shi等[3]报道，PDLIM5高表达与非小细胞肺癌预后不良相关。Liu等[5]同样发现，PDLIM5高表达的前列腺癌患者预后不良。本组对Kaplan-Meier Plotter数据库中PDLIM5的表达进行挖掘，发现其中7个基因芯片数据(203242_s_at、211680_at、211681_s_at、213684_s_at、216803_at、216804_s_at、221994_at)，结果显示：PDLIM5 mRNA高表达患者较低表达患者的OS明显缩短(P均<0.05)。PDLIM5蛋白表达水平与患者的OS无相关性(P=0.761)。

综上所述，本实验结果显示，PDLIM5在胃癌组织中的表达显著高于癌旁胃黏膜组织，且PDLIM5在pMMR型胃癌患者中的表达高于dMMR型患者。PDLIM5 mRNA高表达患者较低表达患者OS明显缩短。PDLIM5有望成为胃癌潜在的预后标志物。