医用胶水应用换药对小鼠急性创面愈合速度的对比研究

曹亿，彭吉才，钟广正，朱颉*

医用胶水越来越多地替代创伤或手术后伤口/切口的缝合术，这种关闭创面、止血和密封伤口的作用甚至可产生更好的伤口护理和美容效果［1，2］。由于医用胶水易于使用，节省手术时间，促使研究和开发更具生物相容性、更低的细胞毒性、更好的组织弹性的高湿粘合强度医用胶水［3］，各种天然生物聚合物如纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、白蛋白、壳聚糖用于制备医用胶，这些生物聚合物具有化学和生理相互作用比如凝血过程［4］，并已用于神经外科、骨科、牙周、眼科、心血管、气胸、胃肠、整形和重建手术［2］。由于医用胶水中存在的不同官能团的相互作用、化学相互作用涉及到聚合物的润湿和溶胀、聚合物链和粘膜之间的相互作用，加之临床实践上常见到的使用医用胶后创面迅速愈合现象，作者认为医用胶水不但能够缩小创口或创面，还可能与创面组织相互作用促进创伤愈合。本文通过建立小鼠撕脱伤急性创面模型，研究医用胶涂抹创面是否影响组织愈合。

1 材料和方法

1.1 动物模型的建立

1.1.1 实验动物及材料SPF级健康雄性C57小鼠18只，质量（20±2）g，购自中山大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2016⁃0029。动物在中山大学实验动物中心SPF级实验室统一饲养，饲养环境、温度、湿度、光照按照SPF级饲养条件实施。实验方案符合《赫尔辛基宣言》的原则。医用胶水为α⁃氰基丙烯酸正丁酯医用粘合剂，由广东龙心医疗器械有限公司生产，许可证号：20010379。

1.1.2 造模、分组、伤口护理将小鼠用乙醚吸入进行麻醉，剃去背部毛发，75%乙醇消毒，在小鼠背部正中标记1个面积约3 cm2的长方形区域，用无菌手术刀沿长方形标记切除皮肤，创面深达真皮，未及筋膜层，大体观察可见创面表皮完全缺失，真皮部分缺失，创面呈鲜红色，后用碘伏消毒。随机分为三组（每组6只小鼠）：①医用胶组：创面涂以医用胶水，干燥后用纱布覆盖包扎；②凡士林组：创面用凡士林覆盖后，纱布包扎；③对照组：直接用纱布包扎固定。以上三组每2天换药一次。

1.1.3 组织的获取各组分别于修复第0、2、6、10天进行分子生物学检测，第10天进行组织学检测，评估皮肤创面修复效果。麻醉动物后，准备手术。用生理盐水清除伤口表面的渗液后，在创面中心用手术刀取活检组织并存储在无菌离心管，4℃保存。定量分析评价，第0、2、6、10天免疫印迹（Western blotting）、酶联免疫（ELISA）。组织病理学进行免疫组化、免疫荧光评价，第10天安乐死动物后，在动物竖脊肌处取一大小约1 cm×0.5 cm×1 cm组织，固定在10%甲醛中并于4℃储存，直到切片和染色。

1.2 测定指标

1.2.1 计算创面愈合率 采集每组小鼠的创面图像，用ImageJ软件计算创面面积，得出创面愈合率。创面愈合率=（原始创面面积⁃未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。

1.2.2 免疫印迹（Western blotting）检测炎症介质IL⁃6、TNF⁃α表达炎症介质IL⁃6、TNF⁃α在伤口组织的表达是通过免疫印迹评估的。提取组织总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，SDS⁃PAGE电泳，湿转仪转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，滴加一抗（鼠标抗体），4℃过夜，TBST洗涤5 min×3次，加入二抗（羊抗兔），室温孵育1 h，洗膜，ECL试剂显影成像。用ImageJ软件对目的条带进行灰度分析。

1.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IL⁃6和TNF⁃αIL⁃6和TNF⁃α表达量按照ELISA试剂盒试验方法测定。

1.2.4 免疫组织化学分析IL⁃6、TNF⁃α表达情况

取全层创面组织及少许周围正常组织，40 g/L多聚甲醛溶液固定，常规脱水、透腊、包埋、切片。进行苏木精⁃伊红染色，观察创面治疗后的表皮、真皮、皮下组织细胞、纤维增生情况。采用相应IL⁃6、TNF⁃α的一抗及二抗，了解IL⁃6、TNF⁃α表达量的情况。

1.3 统计分析

采用SPSS 25.0对数据进行统计分析。计量资料用（±s）表示，三组间均数比较，用单因素方差分析（One⁃way ANOVA），组间两两比较采用Bonferroni法，方差不齐则采用秩和检验；以P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 创面愈合率

随着治疗时间的延长，三组小鼠创面面积都在逐渐缩小。如图1所示，第6天开始，医用胶组和对照组脱痂现象较明显；第10天医用胶组创面接近完全愈合，其次为对照组，凡士林组愈合较慢。统计分析第2、6、10天三组创面愈合情况见表1、表2，医用胶组分别与凡士林组、对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 不同时间点小鼠大体创面愈合情况

表1 不同时间点各组创面面积情况比较（cm2，x±s，n=6）

表2 不同时间点各组平均创面愈合率（%）

2.2 免疫印迹（Western blotting）检测IL⁃6、TNF⁃α的表达情况

免疫印迹结果如图2所示，第0、2、6、10天测得三组IL⁃6、TNF⁃α的表达情况，同一组内的表达量呈先增高后降低的趋势；不同组间同一时间点比较，医用胶组表达最少，其次为对照组，凡士林组表达最多。医用胶组与凡士林组比较，差异具有统计学意义（IL⁃6组第2、6天P＜0.05；TNF⁃α组第2、6、10天P＜0.05）。

图2 不同时间点免疫印迹检测IL⁃6、TNF⁃α表达情况

2.3 ELISA检测IL⁃6和TNF⁃α的表达情况

ELISA结果如图3所示，第2、6、10天酶联免疫（ELISA）检测炎症介质IL⁃6、TNF⁃α表达量，同一组内的表达量呈先增高后降低的趋势；不同组间同一时间点比较，医用胶组表达最少，其次为对照组，凡士林组表达最多。医用胶组分别与凡士林组、对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）

图3 不同时间点ELISA检测IL⁃6和TNF⁃α表达情况

2.4 免疫组织化学检测IL⁃6、TNF⁃α的表达情况

第10天免疫组化、HE染色结果如图4所示，炎性细胞浸润胶水组少于凡士林组及对照组；IL⁃6、TNF⁃α表达量，胶水组表达最少，其次为对照组，凡士林组表达最多。

图4 第10天免疫组化检测IL⁃6、TNF⁃α的表达情况（HE染色，×200）

3 讨论

医用胶是一种用来粘合伤口的成熟的化学制剂。我国1962年起开始研究和生产医用胶粘剂，迄今为止，主要品种有α⁃氰基丙烯酸乙酯、丁酯、异丁酯等，用作替代外科手术缝合及组织粘合［5］。与传统缝合术相比，它具有操作简单、术后伤口疤痕小、方便护理等优势，在临床创面的应用范围越来越广泛，因而受到重视。本实验选用的胶水成分是α⁃氰基丙烯酸正丁酯，为软组织胶粘剂，主要通过初级化学键粘合方式与底物粘合［2］。它还具有可以在体内分解、排泄等特点，可用于皮肤切口粘合、食管和肠管再吻合粘接、血管的粘接、缺损组织的修补、瘘孔的封闭、渗出液的封闭，以及脏器手术中的止血等［6-8］。

急性创面的愈合过程是一个连续的复杂的生物化学反应过程。一般包括三个阶段，即炎症期、增生期和重塑期。炎症期：此期开始于受伤后第1～4天，纤维蛋白凝块形成。血小板是第一个动员到创面的细胞，这些细胞释放血小板源生长因子（PDGF）。在炎症期，主要参与的是中性粒细胞和巨噬细胞，伴低水平的蛋白酶。这些化学介质帮助分解细胞外基质以便于新基质的形成。增生期：此期发生于受伤后第4～21天，成纤维细胞起主要作用。此期主要是血管生成、上皮形成和肉芽形成的时期。重塑期：在重塑期，胶原进入到创面内，增强张力。胶原交联和纤维增加，在前两个阶段生成的大量细胞进入到程序性细胞死亡和凋亡的过程中。本实验从小鼠大体创面的修复面积速度上以及免疫组化HE染色上可以看出，医用胶组修复较其他组快，且炎性细胞浸润较其它组少，局部无不良并发症。应用胶水在处理创面上具有安全性和有效性。

IL⁃6和TNF⁃α被认为是参与皮肤再生的关键促炎因子，大量的促炎可以扩大和延长炎症反应［9，10］。本实验通过免疫印迹、ELISA及免疫组化等方法，从定量和定性方面分析IL⁃6和TNF⁃α表达情况。结果证实医用胶组创面炎症介质的各指标表达量少，创面修复快，可以加快创面的修复。此外，第10天组织标本免疫组化图片仍可看到各组较多IL⁃6和TNF⁃α表达量，考虑第10天小鼠创面仍处于增生期、未完全愈合以及近创面伤口取材原因引起。此外分析凡士林组炎性介质表达量高于对照组，可能原因为凡士林纱布油性物质影响伤口炎性反应速度、转归，略慢于空白对照组。但凡士林纱布具有一定的防粘连、止血的作用，值得在对症伤口的护理上应用和肯定。

总之，医用胶水建立了细菌进入伤口的物理屏障，它的促进伤口愈合的效果也可能与减少伤口感染有关［11］。除了在普通皮肤软组织裂伤的伤口应用外，在急性撕脱创面伤口的愈合上，也具有一定的减少炎性介质、促进修复及愈合作用，且具有良好的安全性和有效性，具体的作用机制有待于进一步探讨研究。