海风藤醇提物对慢性硬膜下血肿大鼠的治疗作用及机制

夏士涛， 王培宇， 张开创， 魏静

（黑龙江中医药大学附属第一医院外三科，黑龙江哈尔滨 150040）

慢性硬膜下血肿（chronic subdural hematoma，CSDH）是最常见的一种继发性颅脑损伤。有报道，颅脑创伤为CSDH发生的主要因素，但肝肾功能不全、老年痴呆、代谢性疾病、抗凝药物应用等均亦可引起CSDH[1]。目前，以钻孔引流为主的手术凭借其快捷、安全、方便等优点成为CSDH的首选疗法，但术后死亡率、致残率和复发率居高不下，且患者术后容易并发感染、脑水肿、器官功能不全等，死亡率高。因此，有必要开发安全、有效的CSDH治疗新策略，以改善CSDH患者的预后。海风藤是胡椒科胡椒属植物海风藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi的干燥藤茎，味辛、苦，性微温，入肝经，有祛风、止痛、通络等功效，现代药理研究表明，其具有抗炎、镇痛等作用[2]。前期实验发现，海风藤醇提物对CSDH有明显的疗效。故本研究以海风藤醇提物为研究药物，以阿托伐他汀钙为阳性对照药[3-4]，通过动物实验分析其对CSDH的治疗作用及其可能机制，以期为临床应用提供借鉴，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠60只，7周龄，体质量260~270 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。实验前适应性饲养1周，室温22~24℃，相对湿度40%~60%，自然光照，自由摄食饮水。本实验方案满足一般动物实验伦理学原则，已通过本院伦理委员会批准，审批号：20190511。

1.2 药物及制备海风藤，由湖北省青山中药材公司生产提供，批号：20191204，已经华中科技大学同济医学院陈家春教授鉴定。制备方法：取海风藤7 kg，以体积分数70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，混合提取液，获得乙醇提取物。回收乙醇，浸膏加水混悬，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，蒸干得到正丁醇377.37 g，以0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液配制成7.72、15.44、30.88 mg∕kg海风藤醇提物溶液。阿托伐他汀钙片，辉瑞制药有限公司生产，规格：20 mg，批号：国药准字H20051408。

1.3 试剂与仪器CMC-Na（济宁市贝诺克生物科技有限公司生产）；白细胞介素6（IL-6）、IL-8酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海臻科生物科技有限公司）；凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）检测试剂盒（上海将来实业股份有限公司）；小鼠抗大鼠CD31抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗大鼠缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、紧密连接相关蛋白Claudin-5、GAPDH等抗体（海雅吉生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的免疫球蛋白（IgG）抗体（北京博尔西科技有限公司）。CA-7000全自动血凝分析仪（日本Sysmex公司）；M型小动物核磁共振成像系统（ASPECT Imaging公司）；680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；BH2显微镜（日本Olympus公司）。

1.4 造模与分组抽取50只大鼠采用自体血反复多次颅内灌注法建立慢性硬膜下血肿模型[5]：麻醉大鼠，以俯卧位固定在立体定向架上，在额顶叶中心取切口，暴露颅骨，磨出直径为1 mm的骨窗，在硬脑膜上剪开直径为1 mm的十字切口。用无菌BD注射器取大鼠尾静脉血700μL，注入于硬膜下腔，先以30μL∕min速度注血10 min，再以10μL∕min速度注血10 min。首次注血72 h后，再次取500μL自体血，划开愈合的硬脑膜切口，再次注血，先以20μL∕min速度注血10 min，再以10μL∕min注血10 min。造模大鼠首次注血后第24天用MRI扫描大鼠头部，血肿形成表示造模成功。共40只大鼠造模成功，将其随机分为模型组，阳性对照组，海风藤醇提物低、高剂量组，每组各10只。剩余10只作为假手术组，其造模方法同上，但不注射自体血。

1.5 干预方法阳性对照组造模成功后次日灌胃126 mg∕kg阿托伐他汀钙（以生理盐水配制成溶液），海风藤醇提物低、高剂量组同一时间分别灌胃15.44、30.88 mg∕kg海风藤醇提物溶液[6]，模型组、假手术组亦同一时间灌胃等体积CMC-Na溶液。1次∕d，连续给药14 d。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 大鼠脑血肿体积测定末次给药后1 h，麻醉大鼠，将其置于MRI扫描专用线圈内，进行T2WI序列冠状位扫描，层厚1 mm。选择体积最大血肿的最大断层截面，用核磁工作站软件Volume Viewer 4.3测量血肿的横、纵径，计算血肿体积（mm3）。

1.6.2 ELISA法检测大鼠血清炎症因子IL-6、IL-8含量MRI扫描后，腹主动脉采血，低温离心取血清。参考IL-6、IL-8 ELISA试剂盒说明书检测血清IL-6、IL-8水平，操作如下：在酶标包被板上设置空白孔、样品孔、标准品孔，加样后稀释，温育，洗涤，加入酶标试剂，显色，终止，在450 nm波长下测定各孔光密度值，计算各样本浓度值。

1.6.3 凝固法检测血浆凝血功能指标取血浆用全自动血凝分析仪检测，严格参考PT、TT、FIB试剂盒说明书，采用凝固法检测血浆PT、TT、FIB含量，即将血浆样本试管编号，根据仪器操作流程检验，将结果自动传输到计算机上，统计检验结果。

1.6.4 CD31免疫组织化学染色法检测大鼠血肿包膜新生血管麻醉后处死大鼠，快速分离颅骨，获得脑组织，取注血侧的脑组织液氮冷冻，另一部分脑组织用冰冻组织切片包埋剂包埋脑组织，制作冠状位连续切片（厚8μm），进行CD31血管免疫组织化学染色：将冰冻切片用甲醇固定，用小牛血清封闭，滴加小鼠抗大鼠CD31一抗（稀释1∶100），4℃过夜，取出滴加HRP标记的IgG二抗（稀释1∶1 200），37℃温箱孵育20 min。DAB显色，镜下观察显色情况，蒸馏水终止反应，苏木素复染，盐水酒精分化，1%氨水返蓝，脱水封片。以磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照，其余操作同上。随机选取5个血管密集区，显微镜（400倍）下计数单个条索状CD31阳性血管内皮细胞与彼此分离的血管簇数目，计算平均值，转化为包膜血管密度（MVD）。

1.6.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测大鼠脑组织HIF-1α、Claudin-5蛋白表达水平取液氮冷冻脑组织，放射免疫沉淀分析（RIPA）细胞裂解液进行裂解，离心取上清。二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白质，沸水浴变性，上样，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭。分别加入一抗稀释液HIF-1α（1∶800）、Claudin-5（1∶600）、VEGF（1∶800）、GAPDH（1∶600）孵育过夜，次日加入HRP标记的IgG二抗（1∶2 000）室温孵育0.5 h。加入电化学发光（ECL）试剂显色，用Image J软件分析目的蛋白与内参灰度值的比值。

1.7 统计方法采用SPSS 22.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑血肿体积以MRI观测结果计算血肿体积，假手术组大鼠无颅内血肿不做统计。与模型组比较，海风藤醇提物低、高剂量组及阳性对照组大鼠血肿体积缩小（P＜0.05）；与阳性对照组比较，海风藤醇提物低、高剂量组血肿体积增大（P＜0.05）；与海风藤醇提物低剂量组比较，高剂量组大鼠血肿体积较小（P＜0.05）。结果见表1、图1。

图1 各组大鼠脑血肿体积MRI结果比较Figure 1 Comparion of MRIresults of brain hematoma volume in various groups

表1 各组大鼠脑血肿体积比较Table 1 Comparison of brain hematoma volume of rats in various groups （±s，mm3）

表1 各组大鼠脑血肿体积比较Table 1 Comparison of brain hematoma volume of rats in various groups （±s，mm3）

①P＜0.05，与模型组比较；②P＜0.05，与阳性对照组比较；③P＜0.05，与海风藤醇提物低剂量组比较

血肿体积604.33±23.78 166.69±18.42①415.59±20.25①②241.79±19.47①②③组别模型组阳性对照组海风藤醇提物低剂量组海风藤醇提物高剂量组鼠数（只）10 10 10 10

2.2 大鼠血清炎症因子与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-8水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠血清IL-6、IL-8水平降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠血清IL-6、IL-8水平均升高（P＜0.05）；与海风藤醇提物低剂量组比较，高剂量组大鼠血清IL-6、IL-8水平均降低（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清IL-6、IL-8水平比较Table 2 Comparison of serum IL-6 and IL-8 levels of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

表2 各组大鼠血清IL-6、IL-8水平比较Table 2 Comparison of serum IL-6 and IL-8 levels of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与阳性对照组比较；④P＜0.05，与海风藤醇提物低剂量组比较

IL-8 49.87±3.41 255.15±14.46①92.16±4.66①②211.42±10.58①②③143.15±8.42①②③④组别假手术组模型组阳性对照组海风藤醇提物低剂量组海风藤醇提物高剂量组鼠数（只）10 10 10 10 10 IL-6 51.66±3.14 249.44±15.69①97.42±5.91①②198.63±10.36①②③147.84±7.59①②③④

2.3 大鼠血浆凝血功能与假手术组比较，模型组大鼠血浆PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠血浆PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠血浆PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；与海风藤醇提物低剂量组比较，高剂量组大鼠血浆PT、FIB含量升高，TT含量降低（P＜0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠血浆PT、TT、FIB含量比较Table 3 Comparison of plasma PT，TT，FIB levels of rats in various groups （±s）

表3 各组大鼠血浆PT、TT、FIB含量比较Table 3 Comparison of plasma PT，TT，FIB levels of rats in various groups （±s）

FIB（μg·mL-1）1.34±0.17 0.71±0.11①1.20±0.12①②0.98±0.12①②③1.07±0.13①②③④组别假手术组模型组阳性对照组海风藤醇提物低剂量组海风藤醇提物高剂量组鼠数（只）10 10 10 10 10 PT（pg·mL-1）99.15±5.42 60.31±2.34①87.66±2.48①②71.32±1.45①②③80.63±2.16①②③④TT（pg·mL-1）62.66±7.61 87.41±6.28①68.41±2.54①②80.69±4.12①②③74.36±3.69①②③④

2.4 大鼠血肿包膜MVDCD31为血管内皮标记，可作为血肿包膜MVD观察指标。与模型组比较，阳性对照组，海风藤醇提物低、高剂量组血肿包膜MVD增大（P＜0.05）；与阳性对照组比较，海风藤醇提物低、高剂量组血肿包膜MVD数减小（P＜0.05）；与海风藤醇提物低剂量组比较，高剂量组血肿包膜MVD较高（P＜0.05）。结果见表4、图2。

图2 各组大鼠脑组织CD31阳性细胞分布比较（免疫组化染色法，×400）Figure 2 Comparison of distribution of CD31 positive cells in brain tissue of rats in various groups（by immunohistochemical staining，×400）

表4 各组大鼠脑血肿包膜MVD比较Table 4 Comparison of the MVD in the brain hematoma capsule of rats in various groups （±s，条）

表4 各组大鼠脑血肿包膜MVD比较Table 4 Comparison of the MVD in the brain hematoma capsule of rats in various groups （±s，条）

①P＜0.05，与模型组比较；②P＜0.05，与阳性对照组比较；③P＜0.05，与海风藤醇提物低剂量组比较

MVD 9.31±0.78 69.61±5.14①15.69±1.91①②50.85±2.75①②③组别模型组阳性对照组海风藤醇提物低剂量组海风藤醇提物高剂量组鼠数（只）10 10 10 10

2.5 大鼠脑组织HIF-1α信号通路相关蛋白表达与假手术组比较，模型组大鼠脑组织HIF-1α蛋白表达水平升高、Claudin-5蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，海风藤醇提物低、高剂量组HIF-1α蛋白表达水平降低、Claudin-5蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与海风藤醇提物低剂量组比较，高剂量组HIF-1α蛋白表达水平降低、Claudin-5蛋白表达水平较高（P＜0.05）。结果见表5、图3。

图3 各组大鼠脑组织HIF-1α信号通路相关蛋白表达电泳图Figure 3 Electrophoretic diagram of HIF-1αsignaling pathway related proteins in rat brain tissue of various groups

表5 各组大鼠脑组织HIF-1α信号通路相关蛋白表达比较Table 5 Comparison of HIF-1αsignaling pathway related proteins in brain tissue of rats in variou groups （±s）

表5 各组大鼠脑组织HIF-1α信号通路相关蛋白表达比较Table 5 Comparison of HIF-1αsignaling pathway related proteins in brain tissue of rats in variou groups （±s）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与海风藤醇提物低剂量组比较

Claudin-5 0.99±0.09 0.12±0.03①0.39±0.08①②0.75±0.09①②③组别假手术组模型组海风藤醇提物低剂量组海风藤醇提物高剂量组鼠数（只）10 10 10 10 HIF-1α 0.52±0.11 1.25±0.18①0.84±0.13①②0.65±0.12①②③

3 讨论

慢性硬膜下血肿（CSDH）作为一种慢性出血性神经系统疾病，往往因创伤性颅脑损伤，致硬脑膜与硬膜下腔处桥静脉被撕裂，出血聚集在硬膜下腔，形成血肿。当前，CSDH发病机制的研究尚在起始阶段。Fan等[7]研究表明，炎症、血管生成在CSDH发病中发挥了关键作用。故探索与CSDH发作相关的炎症反应、血管生成病理生理机制，开发可改善CSDH预后的新药有一定的临床意义。既往张柯媛等[8]研究表明，海风藤醇提物有抗炎作用，王伟等[9]报道其具有抗血小板聚集的作用。因此，本研究拟观察海风藤醇提物治疗慢性硬膜下血肿的效果及其作用机制。本研究通过脑MRI观察发现：与模型组比较，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠脑血肿体积减小，提示海风藤醇提物可促进脑血肿吸收，效果仅次于经典西药阿托伐他汀。PT是凝血机制中心环节，活化后可形成TT，TT为蛋白水解酶，可水解多种凝血因子，并直接作用于血液中FIB，诱发凝血、血肿生成。一般情况下，PT、TT、FIB处于动态平衡中，CSDH发生后血浆PT活化生成TT，TT释放大量毒性物质、细胞因子，损伤血脑屏障，降低其通透性，导致凝血因子进入血液循环，表现为TT升高、PT下降。本研究结果显示：与模型组比较，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠血浆PT、FIB含量升高，TT含量降低。结合免疫组化染色结果显示：与模型组比较，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠血肿包膜MVD增大。提示海风藤醇提物可调节凝血指标，促使血管形成，这可能是其促进血肿吸收的原因之一。

Zhao等[10]报道，炎症与CSDH密切相关。IL-6是一种生物学功能较多的内源性促炎因子，可增加血管通透性，促进血液渗出，是CSDH形成过程中关键的炎性反应因子。IL-8不仅是炎症反应因子，还可作为趋化因子，促进黏附因子吸引中性粒细胞并将其激活，强化血管内皮细胞等迁移功能，与血管生成密切相关。CSDH持续扩大的炎症反应是IL-6、IL-8等共同作用的结果。本研究结果显示：与模型组比较，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠IL-6、IL-8水平持续降低，提示海风藤醇提物具有抗炎的功效。

CSDH发生后，凝聚在硬膜下腔的血块压迫皮质，形成局部缺血缺氧环境，导致HIF-1α不断累积。HIF-1α是多种信号通路的上游调控因子，也是哺乳动物机体缺氧状态下的重要转录调节因子，被认为在炎症反应中发挥重要作用[11]。Lin等[12]研究表明，HIF-1α被激活后，可促进炎症因子的产生，并激活下游许多经典靶基因如血管内皮生长因子（VEGF）转录，上调VEGF表达。Horecka等[13]报道VEGF与基质金属蛋白酶9（MMP-9）正相关。HIF-1α活化后上调VEGF，导致MMP-9表达升高，降解内皮细胞间的紧密连接蛋白Claudin-5，从而破坏血脑屏障。Berndt等[14]报道Claudin-5是形成血脑屏障紧密连接的主要分子元件，是脑微血管内皮细胞紧密链接中特异性蛋白，其表达下调可影响血脑屏障结构完整性。本研究结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠脑组织HIF-1α表达上调，Claudin-5表达下调；与模型组比较，海风藤醇提物低、高剂量组大鼠脑组织HIF-1α表达下调，Claudin-5表达上调，提示海风藤醇提物可能通过降低血肿周围组织缺氧生成的HIF-1α表达，降低下游产物MMP-9，从而上调Claudin-5表达，保持CSDH血脑屏障的完整性。

综上所述，海风藤醇提物可促进CSDH吸收，调节凝血功能，其机制可能是通过下调HIF-1α信号通路实现的。