孕激素对小鼠脾细胞淋球菌感染模型NLRP3 炎性体表达及Th17/Treg分化的影响

许 莉，陈 娜

武汉市第一医院皮肤科，湖北 武汉 430022

淋病是一种由革兰氏阴性淋球菌（Neisseria gonorrhoeae，Ng）感染引起的性传播疾病。50%以上的女性Ng感染是无症状的，成为淋病防控的巨大隐患，患者因延误就医可引起上行性感染，诱发子宫内膜炎和盆腔炎［1］。前期实验证实女性无症状Ng感染与患者体内孕激素水平增高有关［2］，且动物实验证实孕激素可促进小鼠阴道局部Ng感染［3］，但孕激素是通过何种机制抑制机体的免疫应答并引起无症状Ng 感染有待深入研究。NLRP3 炎性体是一类大分子蛋白质，它能活化半胱天冬酶⁃1（Caspase⁃1），并引起白细胞介素（interleukin，IL）⁃1β、IL⁃18等促炎细胞因子的分泌，参与机体抵抗病原体免疫应答［4-5］。NLRP3 炎性体介导的IL⁃1β表达导致Th17/Treg 失衡，诱导T 细胞向Th17 分化［6］。Th17 细胞及其分泌的细胞因子IL⁃17在机体抵抗Ng感染免疫反应中发挥重要作用［7］。研究发现，Ng 可诱导阴道黏膜局部产生Treg，其与Ng 慢性无症状感染有关［8］。我们推测孕激素通过影响NLRP3 炎性体的表达进而导致Th17/Treg失衡，从而在淋病无症状感染中发挥作用。本研究建立小鼠脾细胞Ng 感染模型，观察孕激素对Ng 刺激后NLRP3 炎性体表达及Th17/Treg 分化的影响，为孕激素在无症状Ng 感染中的作用机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI 1640 培养基（Gibco 公司，美国），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），淋巴细胞分离液（北京达科为生物技术有限公司），孕酮（Sigma 公司，美国），TRIzol（Invitrogen 公司，美国），anti⁃NL⁃RP3 抗体（Abcam 公司，美国），anti⁃Caspase⁃1p20 抗体、anti⁃RORγt 单抗、anti⁃Foxp3 单抗（Santa 公司，美国），CD4⁃FITC、CD25⁃APC、IL⁃17⁃PE、Foxp3⁃PE抗体（Ebioscience 公司，美国），逆转录试剂盒（TOYOBO公司，日本），SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa公司，日本），IL⁃17、转化生长因子（fransforming growth facfor，TGF）⁃β、IL⁃10 ELISA 试剂盒（Abcam公司，美国）。

Ng ATCC 49226 标准株由中国药品生物制品检定所提供。菌株经Ng 培养基培养，并制备成D（600 nm）值为0.15的细菌悬液。

1.2 方法

1.2.1 脾细胞体外培养及处理

雌性BALB/c 小鼠，6～8 周龄，体重18～20 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。2%戊巴比妥麻醉小鼠，无菌取脾脏，匀浆分离脾细胞，淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞，RPMI 1640 培养液调整浓度至2×106个/mL。在24 孔板中每孔加入1 mL 脾淋巴细胞悬液，37 ℃、5%CO2培养24 h 后更换培养基，细胞分为5 组：①空白对照组（用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基常规培养3 d）；②Ng组（加入2×107CFU/mL Ng 悬液作用3 d）；③Ng+1×10-9mol/L 孕酮组（预先加入1×10-9mol/L 孕酮作用细胞2 h，再加入2×107CFU/mL Ng悬液作用3 d）；④Ng+1×10-8mol/L 孕酮组（预先加入1×10-8mol/L 孕酮作用细胞2 h，再加入2×107CFU/mL Ng 悬液作用3 d）；⑤Ng+1×10-7mol/L 孕酮组（预先加入1×10-7mol/L 孕酮作用细胞2 h，再加入2×107CFU/mL Ng悬液作用3 d）。实验独立重复3次。

1.2.2 流式细胞术检测Th17细胞和Treg细胞的比例

将每组脾淋巴细胞悬液分为4管，1管用于检测Th17细胞，1管用于检测Treg细胞，另2管分别为相应同型对照。分别加入CD4⁃FITC、CD25⁃APC、IL⁃17⁃PE、Foxp3⁃PE抗体进行染色后，应用流式细胞仪检测Th17细胞和Treg细胞的比例。

1.2.3 实时荧光定量PCR 检测细胞中NLRP3 和Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3mRNA的表达

用TRIzol试剂提取细胞总RNA，取1 μg用于逆转录，逆转录按照逆转录酶试剂说明操作。所用引物序列如下：NLRP3 上游：5′⁃AAGCAGCAGATG⁃GAGACTGGAAA⁃3′，下游：5′⁃TGAACAGAGCCCTG⁃GC AGGTAG⁃3′，扩增产物为149 bp；RORγt 上游：5′⁃TTTGGAACTGGCTTTCCATC⁃3′，下游：5′⁃AA⁃GATCTGCAGCTTTTCCACA⁃3′，扩增产物为123 bp；Foxp3 上游：5′⁃CCCAGGAAAGACAGCAACCTT⁃3′，下游：5′⁃TTCTCACAACCAGGCCACTTG⁃3′，扩增产物为89 bp；内参β⁃actin：上游5′⁃TTCCTTCTTGGG⁃TATGGAAT ⁃ 3′，下 游：5′ ⁃ GAGCAATGATCTT⁃GATCTTC⁃3′，扩增产物为203 bp。

1.2.4 Western blot 检 测NLRP3、Caspase⁃1p20、RORγt、Foxp3蛋白表达水平

提取培养细胞的总蛋白，测定样品蛋白浓度。取各组不同组分蛋白样品60 μg，经10%SDS⁃PAGE电泳分离后电转移膜，加入稀释后的一抗37 ℃孵育1 h，洗膜后加入稀释的特异性二抗及SP⁃HRP 37 ℃孵育2 h，洗膜后用0.05%DAB缓冲液避光显色。

1.2.5 ELISA 法检测细胞培养上清中IL⁃1β 和Th17/Treg相关细胞因子IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10的含量

按照试剂盒说明书进行操作，实验完成后用酶标仪在450 nm 处测定吸光度值，根据制作的标准曲线计算出各组样品的IL⁃1β、IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10含量。

1.3 统计学方法

计量资料以均数±标准差（）表示，进行单因素方差分析（ANOVA），各组间的比较采用LSD 法。应用SPSS 19.0 软件进行统计。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脾脏Th17细胞和Treg细胞比例的变化

流式细胞术结果显示，各组间Th17 和Treg细胞比例差异有统计学意义（F=124.32、148.58，P均＜0.01）。与空白对照组比较，Ng 感染组脾脏Th17 细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例升高。加入孕酮预处理后，脾脏Th17 细胞比例随着孕酮作用浓度的增高而降低，CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例随着孕酮作用浓度的增高而增高，加入1×10-8mol/L 或1×10-7mol/L 孕酮能明显下调脾脏Th17 细胞比例，上调CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例（图1）。

图1 脾细胞中Th17细胞和Treg细胞比例（n=5）Figure 1 The proportions of Th17 cells and Treg cells in murine splenocytes（n=5）

2.2 细胞内NLRP3、Th17/Treg 特异性转录因子RORγt、Foxp3 mRNA表达的变化

RT⁃PCR 结果显示，各组间NLRP3、RORγt、Forp3 mRNA比较、差异均有统计学意义（F=126.48、253.18、119.82，P均＜0.01）。Ng 刺激小鼠脾细胞后，细胞内NLRP3、RORγt、Foxp3 mRNA 表达较空白对照组明显增加，分别为空白对照组的5.48 倍（t=9.46，P＜0.01）、6.18 倍（t=11.82，P＜0.01）和2.74 倍（t=7.47，P＜0.01）。加入孕酮预处理后，细胞内NLRP3、RORγt mRNA 表达水平随着孕酮浓度的增高而降低，Foxp3 mRNA 表达水平随着孕酮浓度的增高而增高。加入1×10-8mol/L或1×10-7mol/L孕酮能明显降低Ng 刺激引起的脾细胞内NLRP3、RORγt mRNA 表达水平，上调Foxp3 mRNA 表达水平，与Ng组比较，差异有统计学意义（t=12.61、9.78、13.29，P均＜0.01，图2）。

图2 细胞内NLRP3、RORγt、Foxp3 mRNA 实时荧光定量PCR结果Figure 2 Real⁃time PCR results of NLRP3，RORγt and Foxp3 in murine splenocytes

2.3 细胞内NLRP3、Caspase⁃1p20、RORγt、Foxp3蛋白表达的变化

Western blot 结果显示，NLRP3、Caspase⁃1p20、RORγt、Foxp3 蛋白各组间差异有统计学意义（F=129.85、123.57、131.62、115.74，P均＜0.01）。Ng刺激小鼠脾细胞后，细胞内NLRP3、Caspase⁃1p20、RORγt、Foxp3 蛋白表达较空白对照组明显增加，分别为空白对照组的5.62 倍（t=10.58，P＜0.01）、5.71倍（t=11.56，P＜0.01）、5.69 倍（t=12.04，P＜0.01）和2.82倍（t=8.39，P＜0.01）。加入孕酮预处理后，细胞内NLRP3、caspase⁃1p20、RORγt蛋白表达水平随着孕酮浓度的增高而降低，Foxp3 蛋白表达水平随着孕酮浓度的增高而增高。加入1×10-8mol/L或1×10-7mol/L 孕酮能明显降低Ng 刺激引起的脾细胞内NL⁃RP3、Caspase⁃1p20、RORγt 蛋白表达水平，上调Foxp3 蛋白表达水平，与Ng 组比较，差异有统计学意义（t=13.48、12.83、10.39、14.36，P均＜0.01，图3）。

图3 各组细胞内NLRP3、caspase⁃1p20、RORγt、Foxp3 蛋白表达情况Figure 3 Expression of NLRP3，caspase⁃1p20，RORγt and Foxp3 proteins in murine splenocytes of each group

2.4 培养上清中IL⁃1β和Th17/Treg 相关细胞因子IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10含量的变化

ELISA结果显示，细胞培养上清中IL⁃1β、IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10 水平各组间差异有统计学意义（F=193.65、219.82、152.56、189.71，P均＜0.01）。Ng 刺激小鼠脾细胞后，细胞培养上清中IL⁃1β、IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10含量明显增加，与空白对照组比较，差异有统计学意义（t=14.81、15.87、12.15、13.49，P均＜0.01）。加入孕酮预处理后，细胞培养上清中IL⁃1β、IL⁃17水平随着孕酮浓度的增高而降低，TGF⁃β、IL⁃10 水平随着孕酮浓度的增高而增高。加入1×10-8mol/L或1×10-7mol/L孕酮能有效抑制Ng刺激引起的脾细胞IL⁃1β、IL⁃17 的分泌，促进TGF⁃β、IL⁃10的分泌，与Ng 组比较，差异有统计学意义（t=11.94、10.28、13.57、12.83，P均＜0.01，表1）。

表1 培养上清中细胞因子IL⁃1β、IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10含量的变化Table 1 The levels of IL⁃1β，IL⁃17，TGF⁃β and IL⁃10 in the cellular supernatant（pg/mL，）

表1 培养上清中细胞因子IL⁃1β、IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10含量的变化Table 1 The levels of IL⁃1β，IL⁃17，TGF⁃β and IL⁃10 in the cellular supernatant（pg/mL，）

与空白对照组比较，*P＜0.01；与Ng组比较，#P＜0.01。

3 讨论

NLRP3炎性体是由NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白Caspase⁃1组成的一种分子量约为700 kDa的大分子蛋白复合体，在细胞质内发挥外源性微生物或内源性危险信号感受器的作用，它能使无活性的Caspase⁃1前体转化为活性Caspase⁃1，后者可裂解IL⁃1β、IL⁃18、IL⁃33前体以形成活性形式并分泌［4］。研究发现，NLRP3 炎性体介导的IL⁃1β的表达导致Th17/Treg 失衡，诱导T 细胞向Th17 分化，引起局部炎症反应和组织损伤［6］。本研究发现，Ng刺激小鼠脾细胞后，Th17 细胞、Treg 细胞比例升高，NLRP3、Th17/Treg 特异性转录因子RORγt、Foxp3 mRNA 和蛋白表达明显增加，细胞上清中Th17/Treg相关细胞因子IL⁃17、TGF⁃β、IL⁃10 水平亦增加。这一结果表明在Ng 感染小鼠脾细胞的体外模型中Ng 可诱导NLRP3 炎性体表达，促进Th17、Treg 分化和免疫反应。Th17 和Treg 分别在促进免疫应答和抑制免疫方面发挥关键作用。研究发现，Ng在体内及体外实验中能选择性地诱导Th17 免疫反应。Th17 细胞及其分泌的细胞因子IL⁃17可触发机体的天然免疫反应，包括诱导中性粒细胞趋化、产生抗菌蛋白［7］。感染Ng后阴道黏膜局部产生的Treg 与慢性无症状淋球菌感染有关［8］。

孕激素与性传播疾病关系非常密切，孕激素可下调宫颈细胞诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶⁃2的表达并抑制胶原的组织，而且月经周期的激素变化能影响微生物的黏附［9-10］。研究发现女性Ng下生殖道感染发展为上行性感染的敏感性可随着月经周期变化［11-12］。另外前期研究也发现，孕激素通过促进胸腺基质淋巴细胞生成素和TGF⁃β的产生发挥免疫抑制及减轻炎症反应的作用［13］。研究发现，孕酮可促进T细胞向Treg分化，但抑制其向Th17细胞分化［14-16］。这些都说明孕激素具有免疫调节功能，能影响机体对Ng的易感性及炎症反应。本研究预先加入不同浓度的孕酮作用后，Ng刺激的Th17 细胞比例、NLRP3 和Th17 特异性转录因子RORγt mRNA 和蛋白表达、Th17 相关细胞因子IL⁃17 的分泌随着孕酮浓度的增加而逐渐降低，Treg细胞比例、Treg特异性转录因子Foxp3 mRNA和蛋白表达、Treg相关细胞因子TGF⁃β、IL⁃10的分泌随着孕酮浓度的增加而逐渐增加。这表明孕酮可抑制Ng感染诱导的小鼠脾细胞中NLRP3 表达及Th17 分化，促进Ng感染诱导的Treg细胞分化。

本研究发现孕激素通过抑制Ng感染诱导的小鼠脾细胞中NLRP3 表达及Th17 分化、促进Treg 细胞分化而发挥免疫抑制作用。与我们前期在动物体内的研究结果一致，这为解释孕激素在女性无症状Ng感染中的作用机制提供了一定的理论依据，可为女性无症状Ng感染的防治提供新思路，同时也为研制新的抗Ng药物提供新靶点。