长链非编码RNA H19变异基因型与中国人群肾细胞癌发病风险及预后的相关性研究

邓夏珩，吕 强，李鹏超*

1南京医科大学第一附属医院胸外科，2泌尿外科，江苏 南京 210029

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是肾癌的主要类型，分别占男性和女性所有恶性肿瘤的5%和3%［1-2］，其中高达17%的患者在诊断时出现转移，其余30%的患者甚至在手术治疗后也会出现转移［3-4］，总体预后较差。肾癌的发生是一个复杂的过程，涉及环境和遗传因素之间的相互作用［5］。近年来，基因变异已被广泛研究并证明影响RCC的易感性、进展和预后［6-7］。

长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的内源性细胞核糖核酸，缺乏蛋白质编码能力［8］，越来越多的证据表明lncRNA 在各种癌症的发生和发展中起到至关重要的作用［9］。lncRNAH19 是一种父系印记基因，位于人类染色体11p15.5上［10］，通过调节miRNA功能及介导DNA甲基化参与重要的生物学和病理学过程［11］。H19 与胰岛素样生长因子2（insulin like growth fac⁃tor 2，IGF⁃2）基因密切相关，该基因也位于受甲基化印记影响的区域，参与胎儿的正常生长和发育［12］，同时也在癌症的发生发展中发挥功能［13］。研究表明H19异常表达与多种恶性肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、食管癌及肾细胞癌的发生相关［14］。Wang 等［15］研究发现，H19 在RCC 肿瘤组织中高表达，并与肿瘤分期、淋巴结转移及远处转移有关，且H19 表达是RCC 患者临床预后的独立预测因子。新近研究一致表明H19 基因多态性与各种癌症发病风险及预后相关，包括胃癌［16］、结直肠癌［17］、膀胱癌［18］和乳腺癌［19］等。最近一项荟萃分析表明，H19 rs2839698与胃肠癌风险增加有关［20］。鉴于H19 在RCC 发生发展中的关键作用，其基因变异可能与RCC发病及预后相关。然而目前并没有研究探讨此类问题，因此本研究选择H19 最被广泛研究的4 个多态性：rs2839698、rs217727、rs3741216 和rs3741219，并在一项两阶段病例对照研究中评估其与RCC 风险及预后的关系。

1 对象和方法

1.1 对象

本研究始于2004年5 月，得到南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准。所有入组者均为汉族，无血缘基因联系。所有患者均经组织病理学证实患RCC，既往接受过化疗、放疗或有其他类型恶性肿瘤的患者被排除在本研究之外。根据WHO标准及TNM系统进行分级，分为局部（Ⅰ期和Ⅱ期）及晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）RCC。对照组为门诊体检患者，并按照性别和年龄（±5岁）进行频率匹配，排除与患者有遗传关联或有癌症病史的患者。本研究设计为两个阶段：实验组于2004年5月—2009年10月共纳入342例RCC患者和361例对照，每6个月在门诊随访患者，终点为患者死亡或丢失访。其中44 例（12.9%）患者缺少足够的随访信息被排除，最长随访时间为72.0个月，中位随访时间为25.1个月。验证组至今共纳入672例RCC患者和702例对照。所有患者信息均通过标准问卷调查获得，获得知情同意后，捐献5 mL 静脉血。本研究对1 014 例RCC 患者及1 063 例健康对照4 种基因多态性的多种组合进行分型与分析。

1.2 方法

1.2.1 多态性选择

使用UCSC网站（http：//genome.ucsc.edu/）对位于人染色体11p15.5（位置20164062021693）H19 基因及其启动子中的基因多态性进行鉴定，在千人基因组计划的东亚人群中以定位等位基因频率＞0.05 为标准。本研究最终选择并研究rs2839698、rs217727、rs3741216和rs3741219 4个标记多态性。

1.2.2 DNA提取和基因分型

通过蛋白酶K消化及氯仿从外周血中提取基因组DNA，4 种多态性基因分型使用预先设计的Taq⁃Man SNP基因分型试剂盒（Applied Biosystems 公司，美国）进行分析，每个单核苷酸多态性的引物和探针序列可根据要求提供（表1）。在384 孔ABI 7900HT实时聚合酶链反应系统中进行扩增和分析，使用SDS 2.3软件进行等位基因鉴别。每个平板内均包括质控品，以确保基因分型的准确性。随机选择约10%的样本进行重复基因分型，结果100%一致。

表1 基因多态性的引物与探针序列Table 1 Primers and probe sequences of polymorphisms

1.3 统计学方法

基因突变的等位基因频率在分析前使用拟合优度χ2检验检测是否偏离Hardy⁃Weinberg 平衡，采用Student’st检验（连续变量）和χ2检验（分类变量）评估病例和对照组之间的人口统计学特征、特定变量及基因型频率分布的差异。基于Benjamin⁃Hoch⁃berg 方法对4组单核苷酸多态性的多重P值比较进行FDR矫正，当FDR矫正后的P＜0.05时，差异具有统计学意义。H19多态性与RCC风险和肿瘤特征的关系通过计算OR值和95%置信区间（95%CI）进行评估。生存时间为RCC诊断时至死亡或最后一次随访日期，Kaplan⁃Meier曲线评估临床特征与H19不同基因型的生存状态。采用COX回归分析计算HR值和95%CI评估影响RCC预后的独立危险因素。所有分析均使用SAS 9.1.3，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RCC患者及健康对照的临床特征

所有纳入研究的RCC 患者及健康对照的特征分布见表2。其中，病例组与对照组在年龄、性别和饮酒状况方面无显著差异（P＞0.05），病例组中吸烟者、高血压患者与糖尿病患者多于对照组（分别为P=0.021、P＜0.001、P＜0.001）。65.7%的患者临床分期处于Ⅰ期，而19.2%的患者处于Ⅱ期，6.9%和8.2%的患者分别位于Ⅲ和Ⅳ期。21.4%、51.4%、20.6%和6.6%的患者病理分级分别为Ⅰ至Ⅳ级。

表2 肾细胞癌患者与健康对照的特征分布Table 2 Characteristic distribution of patients with renal cell carcinoma and healthy controls

2.2 H19基因多态性与RCC发病风险的关系

H19 rs2839698、rs217727、rs3741216和rs3741219基因多态性与RCC发病风险的关系见表3，对照组4种多态性的基因型频率均符合HWE（P＞0.05）。病例组与对照组中rs2839698 基因型分布显著不同（P=0.003），经多次比较后仍保持显著性（FDR=0.013）。与携带rs2839698 CC 基因型的个体相比，携带rs2839698变异TT基因型的个体与显著增加的RCC 发病风险相关（P=0.005，OR=1.37，95%CI=1.34～3.02）。采用隐性遗传模型，结合CT/TT 基因型，与rs2839698CC基因型相比，RCC风险也显著增 加（P=0.012，OR=1.13，95%CI=1.02～1.55）。但未发现其他多态性与RCC 发病风险的证据，结果表明H19 rs2839698 基因多态性可能赋予个体RCC 的遗传易感性。

表3 H19基因多态性在病例组与对照组中的分布频率及其与RCC风险的关系Table 3 Frequencies of H19 polymorphisms of the cases and controls as well as the linkage with the risk of RCC［n（%）］

2.3 H19 rs2839698基因多态性对RCC患者临床病理特征的影响

探究rs2839698基因型与病例组中RCC 肿瘤大小、临床分期及病理分级之间的关系，以评估H19 rs2839698 基因多态性对RCC 疾病进展的影响。如表4所示，未观察到rs2839698基因型与病理分级之间的显著关联；然而，rs2839698 CT/TT 基因型在肿瘤大小超过4 cm 及临床晚期患者中更常见（CT/TTvs.CC：P=0.003，OR=1.35，95% CI=1.10～1.73；P=0.010，OR=1.63，95%CI=1.08～2.21）。结果表明，与rs2839698 CC 基因型患者相比，CT/TT 基因型患者更可能出现临床高分期。

表4 H19 rs2839698基因多态性与RCC患者临床病理特征的关系Table 4 H19 rs2839698 polymorphism association with clinicopathological features of RCC patients ［n（%）］

2.4 H19 rs2839698基因多态性对RCC患者生存的影响

前阶段结果证明rs2839698 基因多态性与RCC进展相关，采用Log⁃Rank 检验及Kaplan⁃Meier 分析评估rs2839698基因多态性与RCC患者生存之间的关系。rs2839698 基因多态性与RCC 患者生存显著相关（Log⁃rankP=0.007，表5）。与携带rs2839698 CC 基因型的患者相比，携带rs2839698 TT 或CT/TT基因型的患者RCC 生存较差（HR=4.35，95%CI=1.65～16.92；HR=2.24，95%CI=1.10～4.59）。然而，在其他多态性和RCC 生存之间仍然没有发现显著的关联证据。随后，对RCC患者生存进行单因素与多因素COX 分析（表5 及图1），单因素分析显示临床分期、病理分级和H19 rs2839698（隐性遗传模型：CT/TTvs.CC）与肾细胞癌生存相关；在多因素分析中，临床分期是影响RCC 生存的最主要预测因子，其次是病理分级（P＜ 0.001，HR=15.51，95%CI=5.94～40.42；P＜ 0.001，HR=4.89，95% CI=2.58～10.85）。有趣的是，H19 rs2839698（CT/TTvs.CC）也是RCC 生存的独立预测因子（P=0.027，HR=2.24，95%CI=1.10～4.59）。

表5 H19 rs2839698基因多态性与RCC患者生存的关系Table 5 H19 rs2839698 polymorphism association with survival of RCC patients

图1 H19 rs2839698基因多态性对RCC患者生存的影响Figure 1 Effects of H19 rs2839698 polymorphism on survival of RCC patients

3 讨论

本研究探讨了H19 基因多态性与中国人群RCC 易感性及预后之间的关系，结果表明H19 rs2839698 变异基因型与RCC 风险增加相关，且rs2839698 变异基因型与较大的肿瘤和晚期RCC 有关；在多变量分析中，它与临床分期和病理分级均是患者生存的独立预后预测因子。

lncRNA H19 位于染色体11p15.5，作为癌基因参与恶性肿瘤的发生和转移过程［21］。H19属于高度保守的印记基因，存在3种转录变体，分别包含5个外显子和4个内含子，通过调节RNA 及核糖体参与炎症发生、血管形成、细胞凋亡及死亡等进展［22-23］。生物信息学研究表明，脑缺血发生时H19的关联基因主要富集于甲基化、基因印记、RNA 折叠及DNA转录［24］。中国人群研究显示，H19 基因高表达与乳腺癌发生风险呈正相关，且在ER（+）及HER2（+）患者中差异表达更为明显［25］。研究表明，H19 在肾肿瘤中的表达水平明显高于临近的正常组织，且高表达与临床分期级别高及预后较差明显相关［15］；He等［26］表明H19在肾癌中高度表达，通过miR⁃29a⁃3p/E2F1 途径参与RCC 的转移和侵袭。越来越多的证据表明，基因变异在癌症易感性和预后中起重要作用，H19 基因多态性也在各种恶性肿瘤中被广泛研究。Ge等［27］研究表明rs217727 GG基因型携带者在肝细胞癌中H19的表达远高于GA及AA基因型携带者，表明17727G＞A突变可能调控H19表达。结果与我们一致，都表明rs2839698突变基因是胃癌［20］、结直肠癌［17］和肝癌［28］的独立危险因素。Yang 等［28］发现H19 rs2839698变异基因型不仅增加了肝癌风险，而且也是吸烟亚组肝癌预后的潜在遗传预测因子，另外也发现H19 rs2839698CT 基因型的患者预后不良。一项大型多肿瘤Meta 分析显示rs2839698变异基因型在亚洲人群中与肿瘤风险增加相关，而在高加索人群中与肿瘤风险降低相关［29］。本研究结果和既往其他肿瘤中的研究发现基本一致，首先两阶段病例对照研究分析发现H19 rs2839698 位点的突变等位基因T是肾癌的发病危险因素，与野生基因型携带者相比较，携带TT基因型的个体肾癌发病风险增加了1.37倍。此外，在患者群的分层分析中发现，突变基因型携带患者更易罹患较大肿瘤以及临床高分期肾癌，风险分别为野生型患者的1.35 倍、1.63 倍，总体死亡风险为野生型患者的4.35 倍。大量研究证实H19 是促癌基因，如前所述，其不仅在肾癌中高表达，参与肾癌的发生发展，在其他多种肿瘤中，H19 也具有类似作用。因此，我们推测H19 rs2839698 位点的突变等位基因T 具有潜在的生物学功能，其可能通过调控H19的表达甚至功能而影响到肾癌的易感性、进展以及患者预后。

新近研究表明基因变异可能通过改变DNA 及RNA的二级结构来发挥作用［30］，影响miRNA与特定区域的结合亲和力。研究表明，LINC00673 中rs11655237处的G＞A变化可以为miR1231产生一个靶向位点，以一种特殊的等位基因方式削弱了LINC00673的作用，增加胰腺癌易感性［31］。结直肠癌研究也表明MALAT1中rs664589的等位基因C＞G改变，改变了miR⁃195⁃5p与突变区的结合亲和力，导致MALAT1表达增加，促进结直肠癌的生长和转移［32］。SNPfold 预测H19 的二级结构随着rs2839698 C/T 等位基因突变发生改变，表明rs2839698 突变可能通过改变H19 的二级结构来影响RCC 的易感性和预后。此外，H19 rs2839698 多态性位点位于H19基因的3′UTR 区域，可能通过改变相关miRNA 和H19 3′UTR 区域的结合而影响H19的表达和功能。生物信息学预测发现（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/ln⁃cRNASNP#/），H19 rs2839698 位点等位基因从C 突变为T 时，可能会导致hsa⁃miR⁃24⁃1⁃5p、hsa⁃miR⁃4486、hsa⁃miR⁃566 以及hsa⁃miR⁃24⁃2⁃5p 等结合失常，但是产生了hsa⁃miR⁃612、hsa⁃miR⁃5189、hsa⁃miR⁃1285⁃3p 以及hsa⁃miR⁃3187⁃5p的结合位点。我们推测，H19 rs2839698 位点突变可能导致了miRNA 结合状态的变化而影响其表达，进一步参与到肾癌的发展和预后。在上述这些miRNA 中，hsa⁃miR⁃566被报道在肾癌组织和细胞中高表达，并参与了肾癌细胞的侵袭行为［33］。因此，H19 rs2839698 是否和hsa⁃miR⁃566共同参与肾癌的发生发展，可能是未来的一个研究方向。

本研究也有一定局限性。首先，目前的病例对照研究是基于医院就诊人群，而不是基于总体人群，因此，不能排除特定基因型相关的个体存在选择偏差的可能性。此外，我们仅初步探讨H19 rs2839698基因型突变与RCC发病和预后的关系，仍需深入研究其对上下游基因及ncRNA功能影响的具体机制。本研究优势在于采用了两阶段的设计，在一阶段研究关联性分析中发现的结果，进一步在二阶段的研究中得到验证，可以在一定程度上排除因群体选择带来的偏倚；此外，本研究的发现结合生物信息学预测结果，推测hsa⁃miR⁃566 可能与H19 rs2839698变异有关，为将来深入的功能研究提供了方向。

综上所述，中国汉族人群lncRNA H19 rs2839698 变异与RCC 患者发病率及远期预后密切相关，可能是RCC 易感性和生存的遗传预测因子，但具体作用机制仍需进一步验证。