黄瓜细菌性角斑病研究进展

彭月 顾兴芳 张圣平 李宝聚 谢学文 薄凯亮 董邵云 苗晗

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黄瓜是人们生活中常见的具有丰富营养价值的一种蔬菜，近年来随着人们对黄瓜的需求量日益增加，设施黄瓜的栽培面积越来越大。早在20 世纪50 年代，我国就有黄瓜细菌性角斑病发生的报道（方仲达和俞大绂，1956），该病害主要发生在东北、华中和华北等地区，病害发生严重时，病株率可达到100%，使黄瓜减产大半，甚至绝收。我国对细菌性角斑病的研究起步较晚，尤其是关于黄瓜抗细菌性角斑病的分子生物学研究甚少，本文通过对该病害的国内外研究进展进行综述，以期为黄瓜细菌性角斑病病原菌鉴定与检测、抗性鉴定、培育高抗品种等方面提供理论依据。

1 病原菌

1.1 病原菌鉴定

20 世纪80 年代末期，孙福在和何礼远（1988）对从我国3个不同省市的黄瓜病株上分离出来的病菌进行致病性测定、细菌革兰氏染色反应、血清学反应和生理生化特性等鉴定，最终确定黄瓜细菌性角斑病是由丁香假单胞菌黄瓜角斑病致病变种（Pseudomonas syringaepv.lachrymans，简写为Psl）引起的。而后有学者从黄瓜和甜瓜上分离到细菌性角斑病菌株，经鉴定同为Psl（Kritzman &Zutra，1983；金潜和徐兴国，1991）。张吉光等（2010）采用16S rDNA 系统进化的方法再次验证了黄瓜细菌性角斑病是由Psl引起的，并补充了该病原菌的生物学特性。

伊朗学者Parizi 从两个地区的黄瓜大棚中分别分离出11 株和14 株黄瓜细菌性角斑病病株，进行细菌学检测后确定病原菌为Psl，两个地区分离到的病原菌在表型特征和生化特征上相似，Psl菌株之间的地理来源无相关性（Parizi &Taghavi，2015）。波兰学者Słomnicka 等（2015a）从不同葫芦科作物中收集了22 个丁香假单胞菌菌株，其中有9 个来自黄瓜叶片，然后利用多位点序列分型（multi-locus sequence typing，MLST），核糖rDNA 内部转录间隔区（internaltranscribed spacer 1，ITS1），细菌基因组重复序列PCR 技术（rep-PCR）等方法进行病原菌分类鉴定，将菌株分为4 个组，经过测序和BLAST 比对后发现，利用MLST 技术进行菌株分组的结果与基于致病性试验得到的结果较为一致。

孟祥龙（2017）采集了我国6 个省市的样本，共获得125 株病原菌，首次发现引起我国黄瓜细菌性流胶病的病原菌有两种，分别为Psl和胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种（Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense，简写为Pcb）。Psl占所有病原菌的66%，是引起黄瓜流胶现象的主要原因，而Pcb会引起黄瓜细菌性茎软腐病；虽然许多丁香假单胞菌菌株已经被确定，但迄今为止，只有少数几种致病菌菌株的基因组被测序。Słomnicka 等（2018a）研究了Psl菌株814/98 的基因组序列，发现其基因组大小为6.58 Mb，CG 碱基含量为57.97%。该基因组共鉴定出6 024 个编码蛋白质的基因和92 个编码RNA 的基因，发现了3 个特殊的质粒和24 个Ⅲ型效应蛋白。

研究表明Psl除侵染黄瓜外，还可侵染甜瓜、西瓜等，引起叶斑、角斑等症状。而在葫芦科植物中，黄瓜发病症状表现最明显。张昕等（2001）从新疆北部的哈密瓜生产区采集分离纯化菌株，发现侵染叶片的病原菌为Psl，但侵染果实的病原菌可能还包括果斑菌（Acidororax avenaesubsp.citrulli），证明侵染叶片和果实的病原菌并不完全是同一个。李亚利（2006）的试验结果表明甜瓜细菌性叶斑病菌与西瓜细菌性果斑病菌的寄主一致，并且判定在甘肃省河西地区的甜瓜细菌性叶斑病病原菌主要是Psl；高润蕾（2009）从内蒙古的哈密瓜细菌性叶斑病的叶片上分离菌株，回接后确定其为Psl。上述学者将从瓜类的病叶上分离出的病菌均鉴定为Psl，但后续有其他学者提出不同的见解，代园凤（2013）发现黄瓜株系和甜瓜株系上的丁香假单胞菌在致病性上存在差异，进行系统发育分析和多重序列比较分析后，证明2 种分离物在遗传上明显存在差异，这2 个株系上的致病菌很可能为不同致病变种，建议将甜瓜株系单独命名为丁香假单胞菌甜瓜致病变种。

1.2 危害症状

细菌性角斑病在黄瓜的苗期和成株期均可发病，危害黄瓜的叶片、茎和果实等部位。该病的发病症状与霜霉病极其相似，表型鉴定时需仔细辨认。苗期发病时，子叶会出现黄褐色水浸状的斑点，后期斑点面积逐渐变大连成片，最终导致叶片干枯、幼苗死亡；成株期发病时，叶片初期会出现黄色圆形小斑点，后期圆形斑点由于受叶脉限制而发展成为多角形褐色斑点。湿度大时被害部位产生乳白色菌脓，病斑变透明并在后期严重时穿孔，果实表面产生水珠状菌脓并伴有臭味（Dessert et al.，1982；陈明和赵永波，2010；李宝聚和李焕玲，2012；刘燕妮 等，2018）。

1.3 发病规律

低温高湿是黄瓜细菌性角斑病发生的主要外界条件。发病及流行的最适环境温度为15～25 ℃，空气相对湿度为75%以上；空气相对湿度越大，病害发生越严重。另外水肥灌溉不合理、连作、植株栽植密度过大都会导致病害严重发生。病菌可附着在种子表面和内部，播种后子叶直接被侵染；病菌还可从伤口处侵入，从伤口侵入潜伏期短，1 周内就会出现病斑，湿度过大时受害部位产生菌脓。病菌可通过雨水飞溅、昆虫活动、农事操作等传播途径进行重复多次感染（Bhat et al.，2010；李宝聚和李焕玲，2012；刘燕妮 等，2016；刘兆良 等，2017）。

1.4 致病变种的鉴定与检测

致病变种的鉴定与检测是一项非常重要的工作，通常需要依据细菌学一系列复杂的理化特征等方法来鉴定。传统细菌学鉴定方法作为植物病原菌研究的基础，对于病原菌生理生化、表型等性状的描述是必不可少的。传统的病原菌鉴定方法主要有表型分析鉴定（细菌菌落形态鉴定、革兰氏染色法等）、理化特性测定（氧化酶反应、是否产生荧光色素等）、不同代谢产物的理化鉴定（BLOLOG 鉴定、脂肪酸鉴定）、烟草过敏性反应测定等。之后随着技术的进步，细菌学的鉴定方法得到了进一步的发展，分子生物学鉴定方法也应用到了丁香假单胞菌的划分及致病变种的鉴定当中。学者们基于细菌基因组序列（核酸杂交技术、RAPD 技术、RFLP 技术、rep-PCR 技术等）、保守序列基因（16S rRNA 序列分析、ITS 序列分析）、特定致病基因及致病相关基因的PCR 检测等方法对丁香假单胞菌进行了一系列快速而准确的鉴定，对后续病害诊断及防治有着十分重要的意义（Gardan et al.，1999；焦振泉和刘秀梅，2001；夏明星 等，2005；刘鹏 等，2006；Kvitko et al.，2007；Olczak-Woltman et al.，2007；王哲 等，2011；李宝聚 等，2015a；孔维文等，2016）。

2 黄瓜细菌性角斑病抗性鉴定

植物抗病育种中一项非常重要的工作便是抗病性鉴定，抗源的筛选、后代的选择、品种的推广都离不开抗病性鉴定。细菌性角斑病常用的抗病性鉴定方法有苗期人工接种鉴定和田间自然鉴定。由于田间自然鉴定中外界环境条件不可控，因此鉴定结果准确性不高。因此现在多采用苗期人工接种鉴定法，并制定了相应的技术规程和标准。

2.1 苗期接种技术

苗期对抗源材料进行筛选及鉴定，可以提高选择高抗品种的效率及缩小选择范围，加快抗病育种进程。在实施“八五”和“九五”国家攻关计划的过程中，李淑菊（1999）所在团队携手中国农业科学院等其他几个团队共同完成了黄瓜上4 种病害的多抗性鉴定技术和8 种病害苗期人工接种抗病性鉴定技术，其中包括细菌性角斑病苗期人工接种鉴定法，即在黄瓜第1 片真叶时期进行喷雾接种，接种浓度为3 × 108cfu·mL-1，接种温度为23～26 ℃，接种后保持湿度48 h 以上。目前我国黄瓜抗病研究大多采用上述提到的“八五”国家攻关项目统一标准进行苗期接种。

2.2 抗病性调查及评价标准

接种后5～7 d 调查发病情况，调查表型所采用的参考标准不同，得出的结论也有所不同。调查表型时使用的标准主要分为两类，一类采用0/1评价量表对植物发病症状进行划分，叶片病斑周围无黄绿色晕圈记为0，即存在抗性；叶片病斑周围有黄绿色晕圈记为1，即易感。另一类是根据叶片上病斑的数量和大小，采用1～5 级（李树德，1995）或1～9 级（Olczak-Woltman et al.，2007）评价量表，再依据评价等级计算病情指数，病情指数越低代表品种越抗病。Dessert 等（1982）和Zhang 等（2019）发表的文章中采用第一类作为表型鉴定的标准，Olczak-Woltman 等（2007）和Wang 等（2019）采用的是第二类，而Olczak-Woltman 等（2008）和Słomnicka 等（2018b）则是参考以上两种标准进行表型鉴定。

3 黄瓜抗细菌性角斑病分子生物学研究进展

3.1 细菌性病害在其他作物上的分子生物学研究进展

细菌性病害是影响我国农业优质高产的一类重要病害，其中造成黄瓜细菌性角斑病的丁香假单胞菌在植物病害上的发生率居于植物细菌性病害之首（Mansfield et al.，2012），可导致菜豆晕疫病、桃树溃疡病、十字花科黑斑病、番茄斑点病等病害的发生（王丹丹和王清明，2017）。

粮食作物中由丁香假单胞菌引起的细菌性病害对豆科植物的危害较重，引起大豆细菌性斑点病的病原菌为丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringaepv.glycinea），研究表明大豆对该病菌的抗性是由多基因控制的数量性状遗传（Ariyarathne et al.，1999）。目前已有学者将大豆细菌性斑点病的抗病基因Rpg1和Rpg4定位到13 号和3 号染色体上（Ashfield et al.，2003）。程伟（2016）利用江淮大豆为试验材料进行QTL 定位，在13、14 号和18 号染色体上定位到细菌性斑点病的抗性位点。梅宏瑶等（2020）利用野生型大豆为材料，发现了6 个与抗细菌性斑点病相关的QTL 位点，并得到41 个候选基因。豆科植物中细菌性晕疫病的病原也同为丁香假单胞菌。国外学者Miklas 用菜豆作为试验材料研究细菌性晕疫病，基于连锁定位的遗传研究确定了Pv02、Pv04 和Pv10 3 条染色体上主效R基因的位置（Miklas et al.，2009，2011，2014）。Tock 等（2017）构建了3 个重组自交系的连锁图谱，并进行GWAS 分析，发现1 个具有广谱性的主效QTL 位点位于Pv04 染色体上，还检测到Pv05 染色体上有1 个与菜豆晕疫病密切相关的抗性基因位点。

丁香假单胞菌还是很多果树、蔬菜病害的致病菌，例如茄科、葫芦科、十字花科等。番茄细菌性斑点病是由丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringaepv.tomato）引起的（蔡义勇，2007）。Pto抗病基因是1 个在番茄中具有广谱性的抗性基因（Tang et al.，1999），它位于5 号染色体上（Pitblado et al.，1984），是由Martin 等（1993）采用图位克隆的方法分离出来的。蔬菜上的细菌性黑斑病主要危害十字花科的油菜、甘蓝、萝卜等，其病原（Pseudomonas syringaepv.maculicola）与番茄细菌性斑点病病原亲缘关系最近，采用PCR技术单独检测出此变种有一定难度（叶露飞 等，2015；王道泽 等，2016）。另外猕猴桃细菌性溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonassyringaepv.actinidiae）引起的，其抗性由1 对主效基因控制（易盼盼 等，2015）。李淼等（2009）通过RAPD 技术分析不同猕猴桃品种与细菌性溃疡病抗性之间的关系，发现抗细菌性溃疡病材料中都含有1 条大小为1 458 bp 的DNA 片段，而感病材料则没有这一片段。

3.2 黄瓜细菌性角斑病抗病性遗传规律研究

关于黄瓜细菌性角斑病抗性遗传规律研究的报道较少，最早的研究是由Chand 和Walker（1964）发表的，此研究将病害的严重程度用受侵染叶片上出现坏死和失绿变黄的病斑的数量和大小来表示，并证明黄瓜细菌性角斑病抗性为多基因控制的数量遗传。后来Dessert 等（1982）将黄瓜对细菌性角斑病的抗性划分为抗病和感病2 种类型，抗病型黄瓜叶片上的病斑周围有很小甚至没有黄绿色晕圈，而感病型叶片的病斑周围有黄绿色晕圈，遗传分析结果表明黄瓜细菌性角斑病抗性是由单个隐性基因控制的。此后数年，在此领域一直未有更进一步的研究报道，直到2008 年，Olczak-Woltman 等综合前人研究，利用两组参数再次研究了该病的抗性遗传规律。他们将鉴定材料分为2 组，第1 组表型划分方式与Dessert 等（1982）一致，第2 组与Chand 和Walker（1964）一致。试验结果表明，根据受感染叶片坏死点周围是否存在黄绿色晕圈，可得出黄瓜细菌性角斑病的抗性是由单个隐性基因控制的；而以黄瓜叶片上病斑的数量和大小作为表型鉴定的标准，通过对F2和回交世代的分析，则证实其抗性是由多基因控制的，抗性遗传率约为53%，这个结果与上述Chand 和Walker 的研究结果一致（Olczak-Woltman et al.，2008，2009；秦智伟 等，2009）。

由此可见，由于所用研究材料的遗传背景不同，抗病性鉴定方法不统一，再加上细菌性角斑病病原菌在不同国家和地区可能存在致病性差异，导致目前黄瓜细菌性角斑病的抗性遗传规律还不甚明确。

3.3 黄瓜细菌性角斑病抗病基因遗传定位研究

黄瓜细菌性角斑病抗病相关分子标记研究相对滞后，直到近年才有少量报道。Olczak-Woltman于2009 年发现了1 个与细菌性角斑病抗性相关的RAPD 标记OP-AO07，该标记与细菌性角斑病抗性位点之间的遗传距离约为13 cM（Olczak-Woltman et al.，2009）。Słomnicka 等（2015b）利用Gy14 ×B10 重组自交系群体，用生物信息学方法初步筛选出222 个在亲本间有多态性的SSR 标记，并且发现位于5 号染色体上的SSR00398 可能与细菌性角斑病抗性基因有关。金仲恩等（2017）发明了一种用于检测黄瓜种子中细菌性角斑病菌的分子标记P1、P2 和P3。吴志明等（2019）基于黄瓜细菌性角斑病抗性基因CsPSL的SNP 位点开发了1 个KASP 标记，并申请专利，但关于该基因的具体信息及功能还未见报道。

目前仅有少数研究定位了黄瓜细菌性角斑病抗病相关的基因/QTL 位点，尚未见对该基因进行克隆及分子调控机制研究的报道。Słomnicka 利用Gy14 × B10 重组自交系群体，使用SNP 标记构建包含7 个连锁群，717 个位点的遗传图谱，图长599.7 cM，平均距离为0.84 cM，最终在5 号染色体上检测到psl5.1和psl5.2这2 个主效的QTL 位点（Słomnicka et al.，2018b）。Zhang 等（2019）利用抗病亲本IL52 与易感亲本长春密刺（CCMC）杂交，培育出含155 个株系的F6重组自交系。研究结果表明，在该群体中细菌性角斑病抗性由单隐性位点psl-1控制，并将psl-1定位到1 号染色体的3 118 855～3 951 558 bp 区间。Wang 等（2019）发现Gy14 × WI2757 群体中dm1、cla、psl是同一位点，黄瓜对3 种病害的抗性可能是由同一个基因CsSGR（Pan et al.，2018）控制的，但其分子机制尚未研究清楚。

上述研究对于开展黄瓜细菌性角斑病的分子标记辅助育种奠定了一定的基础，但是黄瓜细菌性角斑病抗性究竟由多少个基因控制，这些基因的抗病分子机制及其调控网络还不清楚。

3.4 抗病种质资源筛选与应用

优异抗病种质资源的收集评价是开展抗病育种的前提。早在1997 年，Chen 等就将栽培黄瓜与野生近缘种黄瓜种间杂交得到抗霜霉病的材料IL52，该材料最初被广泛应用于霜霉病抗性遗传分析（Chen et al.，1997，2003；Pang et al.，2013）。而后发现IL52 除了有霜霉病抗性外，对白粉病也有高度抗性，可作为兼抗霜霉病和白粉病的黄瓜抗源材料（Zhang et al.，2018）。Zhang 等（2019）从这一发现得到启发，将IL52 用于细菌性角斑病的研究中，结果发现IL52 对细菌性角斑病也具有抗性，可以作为黄瓜抗病育种的抗源材料。Wang 等（2019）还发现Gy14 对黄瓜霜霉病、细菌性角斑病和炭疽病均具有抗性。马柏壮等（2013）对222个黄瓜栽培品种进行黄瓜细菌性角斑病人工接种鉴定，发现金满田黄瓜、绿丰园8 号青瓜和新津春4为高抗品种，另外还从52 份黄瓜种质资源中筛选出13 份高抗材料。

综上可知，目前虽已对黄瓜细菌性角斑病抗病种质资源进行了一些评价筛选研究，但抗性种质资源在黄瓜中的应用还极为有限，抗细菌性角斑病的黄瓜品种还极为缺乏，因此今后还需不断加强这方面的研究。

4 黄瓜细菌性角斑病防治方法

黄瓜细菌性角斑病的传播速度极快，发病较为严重。目前对该病害的防治主要以预防为主，在发病前或发病初期采用种子消毒、栽培管理、化学药剂防治、植物诱导等多种方法进行综合防治。

4.1 农业防治

农业防治是防治技术中的一个重要组成部分。在播种前用50%醋酸铜溶液对种子进行药剂消毒，以防种子本身携带病菌（何永梅和李荣，2018）；在植株生长过程中做好日常通风排湿，通过覆盖地膜、小水滴灌等方法进行降湿（黄和喜 等，2018）；同时避免在早晨湿度大时进行整枝打杈、果实采摘等操作，以防止病菌从伤口处侵入（李宝聚 等，2015b）。

4.2 化学防治

化学农药防治一般用于瓜类蔬菜发病初期，可及时用药控制病情。防治细菌性角斑病一般选择铜制剂和抗生素类，如氢氧化铜、春雷霉素和琥珀酸铜等（李宝聚 等，2015b；黄和喜 等，2018）。不同药剂之间交替使用，起到提高药效、降低抗药性风险的作用（陈军和贾冰峰，2012）。一般选择在晴天的早上进行施药，主要喷洒叶片，药剂中还可适当加入展着剂以提高农药的附着能力（吴炳芝等，2001）。

4.3 植物诱导抗病

Kuć 于1982 年提出植物诱导抗病性（Kuć，1982），它指的是经外界因子诱导后，植物体内会对有害病原菌产生抗性的现象，细菌、真菌、病毒均可为诱导剂。植物诱导抗病性类似于高等动物的免疫系统，这是一个利用植物自身的防卫来进行病虫害防治的新途径，其发展前景十分广阔。这个方法在已被病虫害侵染的病株上的效果并不明显，主要被用来预防病虫害，使植物得以健康成长。石延霞等（2008）曾用细菌性角斑病病原菌为诱导物，引起抗病信号的传导，使寄主细胞合成木质素来抵抗病原菌。目前有关植物诱导抗病方面的研究还缺乏深刻认识，需要不断进行探索和研究。

上述防治方法容易导致农药残留、环境污染，且不能彻底切断病原菌侵染途径，不能从根本上解决细菌性角斑病对黄瓜生产的危害，只有挖掘优质抗病资源，选育具有细菌性角斑病抗性的新品种，才是最行之有效的办法。

5 存在问题与未来展望

我国对黄瓜细菌性角斑病的研究起步较晚，近些年来虽有了一些进展，但仍然存在着很多问题：①由于研究者所采用的病原菌接种技术不同，以及进行表型鉴定时采用的抗病性鉴定方法和分级标准存在差异，造成研究结论有所不同；② 在抗性遗传规律方面的研究不够深入，黄瓜细菌性角斑病的抗性遗传规律仍不够明确，存在一些争议；③关于黄瓜抗细菌性角斑病基因的连锁分子标记研究较少，定位区间过大，获得的标记与目标性状之间的遗传距离较远，缺乏与细菌性角斑病抗性基因紧密连锁的可靠标记，无法真正用于分子标记辅助育种，并且黄瓜细菌性角斑病抗病反应的分子机制尚不明确。④ 由于抗病性鉴定条件所限，黄瓜细菌性角斑病抗病种质资源鉴定工作缺乏系统性，对材料的抗性研究也不透彻。加之黄瓜的遗传背景较狭窄，缺乏免疫或高抗的资源，抗性遗传复杂且是多基因数量遗传不利于抗性转育等，这些问题都导致在常规育种中抗病品种选育效率不高。

针对以上问题，可进一步加强以下几方面的研究：①加强对黄瓜细菌性角斑病苗期接种、表型鉴定及鉴定标准的研究工作，摸索出一套完整、简便且有效的接种技术及表型鉴定标准；② 广泛搜集、鉴定抗源材料，拓宽抗病遗传背景，探索与抗病规律相符的育种方法；利用分子标记、基因工程等手段，深入探究抗病分子机制和抗病规律，加快抗病育种进程，提高育种效率。③利用基因组信息开展抗细菌性角斑病基因的精细定位和基因克隆研究，获得大量紧密连锁的可靠标记，建立遗传连锁图谱，实现分子标记辅助选择与常规育种的有机结合，建立优质多抗基因与其他目标基因抗病育种技术体系。④ 最直接有效且经济安全的病害防治措施是选育和使用抗病品种。加强抗性材料的筛选与挖掘，关注多抗基因的聚合，将优质高效的抗病基因导入优良品系，为选择具有复合抗性的黄瓜新品种奠定基础。