黄藤Dof家族的全基因组鉴定及系统进化分析

张丹丹 杨瑶君 江 纳 付 春

（1. 乐山师范学院竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室，四川 乐山，614000；2. 乐山师范学院生命科学学院，四川 乐山，614000；3. 乐山师范学院数学与信息科学学院，四川 乐山，614000）

黄藤（Daemonorops jenkinsiana）是常绿攀援棕榈藤的代表，自然生长在海拔1 000 m以下的低地雨林，黄藤丛生生长，茎可达50 m，节间长40 cm，直径30 mm[1]。黄藤的果实可萃取药品“麒麟血竭”，具有止血、活血、化瘀、止痛等疗效，嫩茎梢17种氨基酸的总含量高达13.14%，营养丰富，可供食用，具有重要的开发价值[2-3]，是热带森林重要的再生非木材资源，但长期的森林采伐和药材采集，使黄藤资源量大幅下降[1]。为了缓解及保护现有的资源状况，一些国家建立了藤种基因收集圃、藤种园等迁地保存基地；同时人们开始了对现有资源的研究利用，特别是在棕榈藤的良种选育方面[4]，目前国内外对黄藤育种的系统研究还比较少。

Dof（DNA binding with one finger）蛋白是一类植物特异性转录因子。Dof基因家族属于单锌指蛋白超家族，一般由200～400个氨基酸构成[5]。Dof蛋白具有明显的结构特征，由N−末端高度保守的Dof结合结构域、寡聚化位点、引导Dof蛋白进入细胞核的核定位区段以及负责C−末端转录调控的激活结构域4个部分组成[6]。其中，Dof结合结构域是由52个保守的氨基酸残基构成的C2−C2型单锌指结构域，在该结构域中有4个绝对保守的Cys残基[7]。Dof蛋白由于其C−末端转录调控域的氨基酸序列较为多变，不具有保守性，因此在植物中的功能具有多样性[8]。目前对玉米（Zea mays）[9]、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）[10-11]、水稻（Oryza sativa）[12]、桃（Amygdalus persica）[13]、草莓（Fragaria ananassa）[14]、香蕉（Musa nana）[15]、毛竹（Phyllostachys heterocycla）[16]、大豆（Glycine max）[17]、甘蓝型油菜（Brassica napus）[18]、小麦（Triticum aestivum）[19]的Dof基因家族成员研究表明，Dof基因家族成员参与到植物体的多种生命活动中，对植物生长发育、光调控、防御机制以及激素调控等过程中的相关基因有重要的调控作用[2]，值得注意的是，关于Dof蛋白的克隆和功能研究主要集中在拟南芥、番茄、水稻等模式植物中，在棕榈藤物种中尤其在黄藤中鲜有报道。

目前，有关黄藤的研究还比较缺乏，仅在黄藤栽培、人工林培育与经营和种子分子标记等方面有过报道[20-22]，但关于黄藤Dof基因家族的理化性质、氨基酸组成、亲疏水性、亚细胞定位、二三级结构等方面几乎没有报道。本研究利用生物信息学方法对黄藤全基因组中的Dof基因家族成员进行鉴定和分析，同时与拟南芥等其他9种物种基因组中的Dof家族成员进行同源比对并构建系统进化树，拟探讨藤本植物（黄藤）基因组中Dof基因家族与其他物种的进化起源关系，为今后进一步研究黄藤Dof基因家族的功能和黄藤育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 数据获取

黄藤（Daemonorops jenkinsiana）全长基因组序列和其蛋白序列来自于国际竹藤中心公布的2种藤本植物基因组数据于GIGADB（http://gigadb.org/dataset/101053）[23]，采用拟南芥数据库TAIR（https://www.arabidopsis.org/）下载拟南芥（Arabidopsis thaliana）Dof基因家族序列和蛋白序列，在植物转录因子数据库 PlantTFDB（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下载毛竹（Phyllostachys heterocycla）、水稻（Oryza sativa）、二穗短柄草（Brachypodium distachyum）、小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、烟草（Nicotiana tabacum）、甘蓝型油菜（Brassica napus）和可可（Theobroma cacao）的Dof基因家族序列和蛋白序列。

1.2 黄藤Dof基因家族的鉴定

先检索下载pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）中Dof基因家族的pfam模型号（PF02701），利用hmmsearch运行命令（hmmsearch --domtblout DjDof.txt --cut_tc zf-Dof.hmm（PF02701）Daemonorops jenkinsiana_protein.fasta）对黄藤蛋白质序列中的Dof基因家族进行预测分析，所得序列为黄藤Dof基因家族的候选蛋白质序列；再利用BlastP比对工具（参数：e值小于10−5）将黄藤中Dof基因家族的候选蛋白质序列与拟南芥36个Dof蛋白的氨基酸序列进行对比，剔除不相关的蛋白质序列后即为黄藤基因组中的Dof基因家族的蛋白质序列，共鉴定出25个黄藤Dof蛋白家族成员。

1.3 分析方法

1）黄藤Dof基因家族的理化特性分析。ExPASy-ProtParamtool（https://web.expasy.org/protparam/）[24]程序分析预测黄藤Dof基因家族编码所有蛋白质的分子量、等电点、亲疏水性、氨基酸组成等理化特性。

2）氨基酸的跨膜结构预测分析。利用TMHMMSeverv.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线程序对黄藤Dof蛋白成员进行跨膜结构域预测分析[25]。

3）亚细胞定位分析。利用在线软件CELLOv2.5[26]（http://cello.life.nctu.edu.tw/）对25条黄藤Dof蛋白序列进行亚细胞定位分析。

4）蛋白的二、三级结构预测分析。利用SOPMA[27]网站对黄藤基因组中的Dof基因家族编码的所有蛋白质的二级结构进行预测分析。利用 SWISS−MOOEL[28]在线网站对其蛋白三级结构进行预测分析。

5）蛋白质的保守基序分析。利用 MEME 7.0.26[29]（http://meme-suite.org/tools/meme）在 线工具对黄藤基因组中的Dof基因家族编码的氨基酸序列的保守基序进行预测分析。参数设置：保守基序个数设置为10，其他参数设置为默认。

6）基因结构分析与染色体定位分析。利用基因结构显示系统GSDS（Gene Structure Display Server）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[6]进行基因结构分析。根据黄藤Dof基因在染色体上的具体位置，使用MapChart软件绘制黄藤基因组中Dof基因家族成员的染色体物理图谱。

1.4 系统进化树的构建

利用 MEGA7.0.26[30]软件对黄藤Dof基因家族编码的蛋白质序列进行多重比对和系统进化树构建分析，构建黄藤与拟南芥基因组中的Dof基因家族的系统进化树以及构建黄藤Dof基因家族与拟南芥等其他9个物种的系统进化树。构建方法采用邻接法，校验参数设置为 Bootstrap 重复1 000次。

2 结果与分析

2.1 黄藤全基因组Dof基因家族的鉴定及其基本信息分析

黄藤Dof蛋白家族的理化特性分析结果表明，黄藤Dof蛋白质成员中氨基酸数目最多的是Dj-Dof20蛋白，有586个氨基酸，最少的为DjDof22蛋白，有184个氨基酸；脂肪族氨基酸指数在49.47～74.51之间；10个成员带负电荷的残基总数多于带正电荷的残基总数，有2个成员正负残基总数相等（DjDof24，DjDof22），13个成员正电荷残基总数多于负电荷总数（表1）。

蛋白质的分子量在20.12～62.42 kDa之间，既含有酸性蛋白又含有碱性蛋白，且碱性蛋白比酸性蛋白多，有11个成员的等电点大于8.0，最大等电点为9.57（DjDof17），最小等电点为4.71（DjDof18）；不稳定系数显示，所有的蛋白均为不稳定蛋白（不稳定系数<40时稳定）；黄藤Dof蛋白均为亲水性蛋白；亚细胞定位结果显示所有黄藤Dof基因家族成员都定位在细胞核上，（表1）；跨膜结构预测结果显示黄藤Dof蛋白都不存在跨膜结构域，即都是非跨膜蛋白。

表1 黄藤Dof蛋白基本信息Table 1 Basic information of the Dof protein in D. jenkinsiana

2.2 编码蛋白的结构分析

2.2.1 编码蛋白的二级结构分析

蛋白质的二级结构主要是指蛋白质的多肽链中有规则重复的构象，从黄藤Dof基因家族成员的蛋白二级结构分析可以看出，其基因家族的二级结构主要为β转角、α螺旋、无规则卷曲、延伸链组成，4种蛋白质的二级结构通常被主要研究[6]。通过预测和分析将有助于认识蛋白的空间结构，其中无规则卷曲主要起连接其他二级结构元件。

同时蛋白二级结构预测结果显示：多数成员以α−螺旋和无规则卷曲为主要二级结构方式，多数成员二级结构的占比高低为 α−螺旋>无规则卷曲>延伸链>β−转角，α−螺旋在成员中占比范围为6.67%（DjDof7）～48.28% （DjDof18）；无规则卷曲占比为39.36%（DjDof18）～83.33% （Dj-Dof7）；延伸链占比为6.05%（DjDof21）～17.74%（DjDof4）；β−转角占比为1.8%（DjDof25）～7.51%（DjDof24）（图1），综上所述，β−转角占比几乎是最少的，延伸链其次，说明β−转角和延伸链分散在整个氨基酸中。

图1 黄藤Dof蛋白二级结构分布Fig. 1 The secondary structure distribution of the Dof protein in D. jenkinsiana

2.2.2 编码蛋白的三级结构分析

利用 SWISS−MOOEL 在线网站分析了黄藤Dof蛋白的三级结构，再根据其构象进行分组。黄藤Dof蛋白可以分为11个组，以A−K表示组别，A组（DjDof7、DjDof8、DjDof12、DjDof13、DjDof17、DjDof22）成员最多有6个；其次为B组（DjDof15、DjDof16、DjDof18、DjDof19），有4个；C组（DjDof1、DjDof4、DjDof10）和D组（DjDof2、DjDof9、DjDof25）有3个；E组（DjDof5、DjDof6）和F组（DjDof3、DjDof23）有2个；其余G（DjDof14）、H（DjDof20）、I（DjDof11）、J（DjDof21）、K（DjDof24）组都有1个，其中组C、组D、组E和组F主要以α−螺旋、β−转角和β−折叠为主，组B、组G和组I主要以α−螺旋为主，组A主要以α−螺旋和β−折叠为主，组H主要以α−螺旋和β−转角为主，组J主要以β−转角为主（图2），该结果说明黄藤Dof蛋白存在保守性和差异性。

图2 黄藤Dof 蛋白3级结构Fig. 2 Tertiary structure of the Dof protein in D. jenkinsiana

2.3 氨基酸序列的保守基序分析

通过MEME对黄藤Dof蛋白保守基序进行了详细的 分析。结果表明，10个独立的保守基序被鉴定，命名为motif1～10，其中motif1为C2−C2单锌指结构，存在于所有的黄藤Dof蛋白中（图3）。该结果表明，在相同组中含有相同保守基序的Dof蛋白也许具有相似的功能。

图3 黄藤Dof 蛋白保守基序分析Fig. 3 The conservative motif analysis of the Dof protein in D. jenkinsiana

2.4 黄藤Dof蛋白家族的进化关系分析

通过MEGA软件运用邻接法对来自黄藤的25个Dof蛋白家族进行进化树分析。根据树的分支可将其分为4组（ClassⅠ−ClassⅣ），分别是ClassⅠ−ClassⅣ，Ⅰ组内有5个成员，成员DjDof25和DjDof11进化速率最快，成员DjDof13的进化速率最慢；Ⅱ组内有8个成员，成员DjDof10和DjDof9的进化速率最快，其次是DjDof19，成员DjDof12和DjDof24的进化速率最慢；Ⅲ组内有5个成员，成员DjDof5和DjDof6的进化速率最快，其次是DjDof1，成员DjDof15的进化速率最慢；Ⅳ组内有7个成员，其中成员DjDof2和Dj-Dof21的进化速率最快，其次是DjDof20，成员DjDof22的进化速率最慢，其中ClassⅡ成员分化速度是最快的，与原始祖先的亲缘关系相对较远。从组别上来看，ClassⅡ成员分化速度是最快的，因而亲缘关系相对较远。从组中来看，ClassⅡ中成员DjDof9和DjDof10分化最快，亲缘关系相对较远，DjDof12和DjDof24分化较慢；ClassⅢ中成员DjDof5和DjDof6分化最快，亲缘关系相对较远，DjDof15分化较慢（图4）。此外，通过MEME软件中的ClustalW功能进行蛋白保守序列比对（图5），结果表明，黄藤Dof蛋白的结构域是高度保守的，且所有Dof蛋白的结构域均含有motif1，进而构成C2−C2单锌指结构，该结果进一步证明了所鉴定的蛋白为Dof家族的成员。

图4 黄藤Dof基因家族的系统发育树Fig. 4 The phylogenetic trees of the Dof gene family in D. jenkinsiana

图5 氨基酸序列比对Fig. 5 Amino acid sequence alignment

通过MEGA软件运用邻接法对来自黄藤的25个Dof和拟南芥的47个Dof进行进化树构建并分析。拟南芥ATDof2.3是复制特异性转录因子，缩短了细胞周期；过表达ATDof5.4通过促进内循环的早期发生，抑制细胞的扩增；ATDof2.4和ATDof5.8在拟南芥不同生长发育过程中发挥不同作用；ATDof6对种子萌发起负调控的作用。该结果表明，黄藤和拟南芥Dof基因家族的系统发育树分为5组，分别是ClassⅠ−ClassⅣ，Ⅰ组内包括黄藤Dof成员8个，拟南芥Dof成员13个；Ⅱ组内只有6个拟南芥Dof成员，不含有黄藤Dof成员，这表明黄藤Dof家族基因的形成迟于拟南芥的分化；Ⅲ组内包括黄藤Dof成员7个，拟南芥Dof成员11个；Ⅳ组内包括黄藤Dof成员和拟南芥Dof成员各4个（图6）。其中DjDof15在2个进化树中分布在2个不同的组中可能是因为在进化过程中发生了蛋白序列的改变。

图6 黄藤和拟南芥Dof基因家族的系统发育树Fig. 6 The phylogenetic trees of the Dof gene family in D. jenkinsiana and A. thaliana

黄藤Dof基因家族成员与来自双子叶植物纲，单子叶植物纲和不同科的代表性植物拟南芥等多个物种的Dof成员分子进化关系分析表明，黄藤和其他9种植物Dof基因家族的系统发育树分为5组，分别是ClassⅠ−ClassⅤ，黄藤Dof蛋白成员主要分布在ClassⅤ，其次是ClassⅢ，ClassⅠ和ClassⅡ中不含有黄藤Dof蛋白成员，可能是黄藤在这2组中的同源基因在进化过程中丢失。亲缘关系越近，说明植物间的共同特征越多；亲缘关系越远，说明植物间的共同特征越少。其中，黄藤的Dof蛋白成员DjDof4和甘蓝型油菜的Dof蛋白成员BRNA2T00148796001、DjDof11和GSBRNA2T00127875001、DjDof12和GSBRNA2 T00141516001、DjDof19和GSBRNA2T00027470-001的亲缘关系最近，与可可的亲缘关系最远。从科分类的角度来分析，黄藤与十字花科的甘蓝型油菜的亲缘关系最近，与可可的亲缘关系最远；从双子叶植物与单子叶植物分类分析，黄藤与小麦的亲缘关系最近，亦是与可可的亲缘关系最远，可能与他们分别属于单双子叶植物有关（图7）。

图7 黄藤和其他物种Dof基因家族的系统发育树Fig. 7 The phylogenetic trees of the Dof gene family between D. jenkinsiana and other species

2.5 黄藤Dof基因家族的结构及染色体定位分析

2.5.1 黄藤Dof基因家族的结构分析

通过在线网站GSDS2.0（gene strucyure display server）对黄藤Dof转录因子家族进行基因结构分析，结果显示黄藤Dof家族成员基因结构简单且相似性较高，均含有1～2个内含子，其中有20个DjDof基因只含有1个内含子，占总数的80%；其余的5条序列（DjDof4、DjDof10、Dj-Dof14、DjDof18、DjDof20）都含有2个内含子，占总数的20%。进1步分析发现，系统进化树属于同一分支的Dof基因，其基因结构也有明显差异，如图8 ClassⅣ中DjDof2、DjDof8、DjDof21、DjDof22只含有1个内含子，其余成员则包括2个内含子。可能是黄藤Dof基因家族在进化过程中相对保守。且各基因长度不等，相差较大。

图8 黄藤Dof家族基因结构Fig. 8 Gene structure of Dof family in D. jenkinsiana

2.5.2 黄藤Dof基因家族染色体定位分析

通过染色体定位分析发现25个DjDofs基因不均匀分布于黄藤24条染色体中，未发现串联重复基因，只有第5条染色体上有2个DjDof基因的分布，其余的染色体都只有1个DjDof基因的分布。可能是黄藤的Dof基因在基因重组的过程中位置没有发生太大的变化（图9）。黄藤Dof基因家族中存在1对重复基因，DjDof5和DjDof6为1对串联重复基因。

图9 黄藤Dof基因在染色体上的定位Fig. 9 The chromosome localization of Dof gene in D. jenkinsiana

3 结论与讨论

Dof家族是植物特有的一类转录因子，在植物生长发育调控和逆境胁迫响应中扮演着重要角色[16]，本研究中利用黄藤全基因组测序数据信息对Dof家族进行了全面分析，共鉴定出25个Dj-Dof家族成员，其数量与水稻（30个）、番茄（34个）、黄瓜（Cucumis sativus）（36个）以及拟南芥（36个）相近，通过统计分析发现Dof家族成员数量与基因组大小并不呈正比例关系。黄藤Dof家族成员内含子数在1～2之间，基因结构相对简单，表明Dof家族的基因结构具有保守性。基因复制事件是植物在进化过程中形成结构相似、功能相仿基因的基础。发现白菜Dof家族基因发生了10次染色体片段重复事件，无串联重复事件发生[16]。发现黄瓜Dof家族基因发生了6次染色体片段重复事件和2次串联重复事件。此外，在大豆、蒺藜（Tribulus terrestris）苜蓿（Modicago sativa）和番茄Dof家族基因中染色体片段重复事件分别发生37、10和8次；串联重复事件分别发生1、1和3次[31-33]。本研究中鉴定到的25个DjDof基因共发生1次串联重复事件，无染色体片段重复事件发生，这表明基因串联重复在黄藤Dof家族扩增和进化中起着重要作用。

本研究结果表明，黄藤Dof家族成员在进化中存在着一定的保守性，主要表现为：1）黄藤Dof蛋白性质与结构的稳定：鉴定得到的25个蛋白不仅在氨基酸数目上较为接近，在分子量上也均为30 kDa左右。既含有酸性蛋白又含有碱性蛋白，正电荷残基数多于负电荷残基数，并均为不稳定蛋白和亲水性蛋白。此外，在二级结构组成比例上，α−螺旋和无规则卷曲为主导。2）基因结构的保守：尽管序列长度上差异较大，但黄藤Dof家族基因在结构上较为相似，均含有1～2个内含子。本研究结果也表明，亚细胞定位显示所有的Dof蛋白都定位在细胞核上，说明Dof蛋白在植物的生长发育中发挥调控作用。

根据进化关系将拟南芥Dof基因家族划分为9个进化亚群[34]，本研究中黄藤Dof基因家族成员同样归为9个进化亚群（ClassⅠ.1，ClassⅠ.2，ClassⅡ.1，ClassⅡ.2，ClassⅡ.3，ClassⅢ.1，ClassⅢ.2，ClassⅣ.1，ClassⅣ.2）。结合黄藤Dof基因家族蛋白的保守基序发现，同一亚群中的Dof蛋白所包含的保守基序类型、数量、排列顺序较为类似；正如已经报道的拟南芥、水稻、胡椒和菊花相同组的Dof蛋白的保守基序一样[35-37]，黄藤同一组的Dof蛋白保守基序的氨基酸序列也是高度保守的（图3），该结果进一步支持了系统发育树中黄藤Dof蛋白的分组。本研究还发现motif1存在于25个黄藤Dof蛋白中，这与拟南芥、黄瓜和番茄的研究结果[38-39]相吻合。亲缘关系的远近用于判断2种植物在结构、功能上的异同点，黄藤与拟南芥的进化关系表明两者亲缘关系不是很近。此外，还构建了黄藤与拟南芥等10种植物的Dof基因家族系统进化树，结果显示，黄藤与甘蓝型油菜和小麦有较近的亲缘关系，序列同源性也较高，与可可亲缘关系最远。

本研究利用生物信息手段对黄藤Dof基因家族编码蛋白的理化性质、跨膜结构、蛋白二三级结构建模、分子进化、基因结构、染色体定位等进行了详细的分析，为了解其调控机制以及通过基因和蛋白来育种，增加其经济价值打下了一定的基础，同时也填补了关于黄藤Dof基因家族生物信息学方面的空白，对深入研究其生物学功能和调控机制具有很重要的意义。