再障膏方对再生障碍性贫血小鼠免疫细胞及脾脏形态和功能的影响

王德好，王文儒，谌海燕，郭 明，郎海燕，李 玲，丁晓庆，刘军霞

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 中国中医科学院，北京 100700；3. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

再生障碍性贫血是一种以骨髓造血功能衰竭为特点的疾病，其发病机制尚不明确，近年来免疫失衡(Th17细胞、 Treg细胞的变化及二者比例失衡)与该病的关系逐渐引起国内外学者的重视[1-2]。脾脏作为髓外机体重要的免疫器官之一，其形态和功能变化与再生障碍性贫血的关系值得学者们探索。再障膏方是北京中医院大学东方医院苏伟教授的经验方，可改善再生障碍性贫血患者的症状，但其作用机制不明。本实验基于再生障碍性贫血模型小鼠，探讨了再障膏方是否可通过调控Treg/Th17细胞失衡来调节再生障碍性贫血的免疫异常状态，并观察了其对脾脏形态和功能的影响。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 选取北京大学医学部提供的近交系BALB/c雌性小鼠56只，SPF级，8～12周龄，体重18～22 g，动物合格证号：SCXK(京)2016-0010。小鼠分笼饲养于北京中医药大学东方医院动物实验室，自由饮食，保持环境清洁，控制温度20～25 ℃、相对湿度50%～70%，隔天更换垫料，定期消毒鼠笼。

1.2药物、试剂及仪器 白消安，上海迈瑞尔化学技术有限公司；环孢素软胶囊，杭州中美华东制药有限公司；再障膏方，由当归、熟地黄、党参、续断、炙黄芪、陈皮、女贞子、白术、川芎、杜仲、茯苓、白芍、丹参、枸杞子、何首乌、鹿角胶、菟丝子、墨旱莲、龟板胶、肉苁蓉、桑寄生等组成，北京中医院大学东方医院制剂室统一浓煎呈膏状，并由药剂室进行药材质量控制。溶血素、CD3单克隆抗体(PE-Cy5标记)、CD4单克隆抗体(FITC标记)、CD25单克隆抗体(PE标记)、Foxp3抗体(APC标记)、RORγt抗体(BV421标记)、FcR阻断剂(CD16/32)、Foxp3染色缓冲组等。高端分析流式细胞仪、全自动血液分析仪、光学显微镜等。

1.3实验方法 将小鼠随机分为空白组8只、模型组18只、中西医结合组10只、再障膏方组10只、环孢素组10只。空白组灌胃无菌注射液；其余组均灌胃白消安片经研磨后制成的悬液(4 mg/mL)建立再生障碍性贫血模型，36 mg/(kg·d)，连续灌胃5 d。自实验第11天开始，模型组与空白组灌胃无菌注射用水0.1 mL，早晚各1次；再障膏方组早上灌胃820 mg/mL再障膏方溶液0.1 mL，晚上灌胃无菌注射用水0.1 mL；环孢素组早上灌胃无菌注射用水0.1 mL，晚上灌胃5 mg/mL 环孢素溶液0.1 mL；中西医结合组早上灌胃820 mg/mL再障膏方溶液0.1 mL，晚上灌胃5 mg/mL 环孢素溶液0.1 mL。各组均连续干预10 d。

1.4观察指标及方法

1.4.1一般情况 每天观察各组小鼠精神体态(口周唇瓣、耳朵爪甲、毛发鼠尾等)、饮食二便、行为活动等，隔天称重并记录，密切注意小鼠有无出血及感染情况并记录。

1.4.2外周血象 于实验第21天，各组小鼠摘眼球取外周血，放入EDTA抗凝管中，轻摇，全自动血液分析仪检测血小板计数(Plt)、红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)水平。

1.4.3外周血Treg、Th17细胞检测 取外周血200 μL,用肝素抗凝,加入CD3 、CD4、CD25单抗和Foxp3抗体和RORγt抗体标记，用流式细胞仪在4 h内检测。

1.4.4体重、脾脏指数与脾脏组织形态学 记录各组小鼠实验开始、实验第11天和实验第21天体重。实验第21天小鼠摘眼球取血后颈椎脱臼处死，取脾脏并称重，计算脾脏指数(脾重/体重)。然后将脾脏置入多聚甲醛中固定，取中间部分修块(厚度以3 mm为宜)后脱水，石蜡包埋固定，冷却后切片，行脱蜡及HE染色，镜下观察脾脏组织形态。

2 结 果

2.1各组小鼠一般状况及存活情况 空白组小鼠耳朵脚爪及口周唇瓣颜色红润，毛发整齐有光泽，饮食饮水正常，二便无异常，反应灵活，体重逐步增加，无死亡。其他组小鼠造模及观察期间开始表现出急躁不安，后来逐渐出现精神欠佳，弓背扎堆现象，唇瓣灰白，爪甲及耳郭苍白，毛发变暗散乱，部分出现口鼻渗血、便血或尾部皮肤出血现象，治疗开始时未有小鼠死亡。模型组于实验第15天起之后每天陆续死亡1～3只，第21天剩余9只，存活率为50%；其余3组小鼠给予药物干预后出血情况有所好转，多数精神活动及饮食较之前明显恢复，大便成形，中西医结合组和环孢素组在治疗后期各死亡3只，存活率均为70%。再障膏方组分别于治疗前期和后期死亡1只和3只，存活率为60%。

2.2各组小鼠外周血象比较 空白组和模型组各有1份样本不合格剔除。模型组外周血中WBC、RBC、Hb、Plt均明显低于空白组(P均<0.05)； 中西医结合组WBC、RBC、Hb、Plt和再障膏方组Plt及环孢素组RBC、Plt均明显高于模型组(P均<0.05)；中西医结合组Plt明显高于环孢素组(P<0.05)，WBC、RBC、Hb与环孢素组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；中西医结合组WBC、Plt均明显高于再障膏方组(P均<0.05)，RBC、Hb与再障膏方组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 空白组和再生障碍性贫血各组小鼠外周血象比较

2.3各组小鼠外周血中Th17与Treg细胞占比及Treg/Th17比较 模型组有3份标本不合格剔除。模型组外周血中Treg细胞占比及Treg/Th17均明显低于空白组(P均<0.05)，Th17细胞占比明显高于空白组(P<0.05)；中西医结合组Treg细胞占比及Treg/Th17均明显高于模型组(P均<0.05)；再障膏方组、环孢素组各指标与模型组、中西医结合组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，再障膏方组与环孢素组各指标比较差异也均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 空白组和再生障碍性贫血各组小鼠外周血Th17、Treg细胞占比及Treg/Th17比较

2.4各组小鼠体重及脾脏指数比较 实验第11天和实验第21天，模型组、中西医结合组、再障膏方组、环孢素组小鼠体重均明显低于空白组(P均<0.05)，中西医结合组、再障膏方组、环孢素组小鼠体重比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；模型组小鼠脾脏指数明显低于空白组(P<0.05)，中西医结合组、环孢素组脾脏指数明显高于模型组和再障膏方组(P均<0.05)，中西医结合组与环孢素组比较、再障膏方组与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 空白组和再生障碍性贫血各组小鼠体重与脾脏指数比较

2.5各组小鼠HE染色脾脏形态比较 各组小鼠脾脏脱水后脾脏形态结构基本可判断，包膜完整。空白组小鼠生发中心可见，脾脏红白髓界限较清楚；模型组小鼠生发中心不可见，且红白髓界限消失；中西医结合组出现散在的生发中心，红白髓界基本可见；再障膏方组红白髓界限模糊，难以识别；环孢素组红白髓界限隐约可见。见图1。

图1 空白组和再生障碍性贫血各组小鼠脾脏形态学表现(HE染色，×200)

3 讨 论

2017年版中国《再生障碍性贫血诊断治疗专家共识》[3]提到，环孢素治疗再生障碍性贫血时用量减少过快会导致复发风险增高，其推荐环孢素服用1年以上至症状完全缓解。但环孢素有明显毒副作用，即使是标准剂量也有部分再生障碍性贫血患者会出现肾功能异常甚至早期死亡[4-5]，且完全缓解后再经过后续的长期治疗会出现克隆进化风险[6]。故寻求有效替代方案或联合治疗减轻环孢素的毒副作用是临床探讨的热点问题。

中医药治疗再生障碍性贫血的研究历史悠久，1999年周霭祥等[7]动物实验研究发现，益肾生血片可促进白消安诱导的再生障碍性贫血小鼠骨髓造血干细胞增殖，提高机体非特异性免疫力、抗感染力和抵抗力。2005年苏伟等[8]研究报道，益气养血补肾法联合康力龙治疗重型再生障碍性贫血总有效率达88.24%，治疗6个月后外周血红蛋白明显升高，其中巨核系改善较慢，红、粒系改善较快。钟永根等[9]和李峻等[10]研究也证实中西医联合用药治疗再生障碍性贫血具有较大优势 。丁晓庆等[11]认为气虚、血虚、肾虚是再生障碍性贫血的基本证候。再障膏方以八珍汤为基础益气养血，重用黄芪，以益气生血、补气摄血；桑寄生、何首乌、肉苁蓉、续断、杜仲补肾填精；加鹿角胶、龟板胶，取龟鹿二仙胶峻补精髓之力；墨旱莲、女贞子滋补肝肾，与二胶成“阴阳双补”之势同时又可循“乙癸同源”。再生障碍性贫血病程较长，患者长期服药，补药多滋腻，妨碍运化，故适当辅以理气化湿之品。本实验结果显示，再障膏方对再生障碍性贫血外周血象的影响与环孢素相似，再障膏方与环孢素合用促进外周血象恢复的效果优于各自单用。

Treg细胞可分为CD4+和CD8+两大类，主要存在于外周血和脾脏中[12]。Treg细胞既可以促进免疫抑制性因子分泌，也可抑制T细胞增殖和活化，负性调控自身反应性T细胞[13]。Th17细胞属于CD4+T细胞，其主要分泌白细胞介素-17(IL-17)，并与多种细胞因子相关构成复杂的网络结构[14]。炎症细胞尤其是中性粒细胞，可被IL-17募集，引起组织破坏与细胞浸润， 导致造血干细胞衰竭，从而损害机体造血功能[15]。Th17细胞与Treg细胞功能截然相反，相互拮抗，二者比值保持动态平衡可维持机体免疫状态稳定，而再生障碍性贫血患者存在Th17/Treg细胞失衡，外周血中Th17细胞相关因子异常增多[16-18]。本实验结果显示，模型组外周血中Treg细胞占比及Treg/Th17均明显低于空白组，Th17细胞占比明显高于空白组；中西医结合组Treg细胞占比及Treg/Th17均明显高于模型组，再障膏方组、环孢素组各指标变化不明显。提示再障膏方联合环孢素可促使再生障碍性贫血小鼠免疫异常状态恢复，但再障膏方和环孢素单独应用作用不明显，单用再障膏方作用不明显考虑是用药时间过短导致。

脾脏是人体重要的免疫器官，脾脏指数可间接反映机体免疫状态[19]，而脾脏形态结构是机体免疫状态的客观体现，其中白髓的主要构成要素为脾脏内的淋巴细胞与血管部分的淋巴鞘，若机体的免疫功能发生紊乱，则红白髓交界模糊，难见生发中心[20]。本实验结果显示，再生障碍性贫血小鼠脾脏指数明显降低，脾脏形态异常，红白髓界限及生发中心消失，提示脾脏功能受损，免疫功能紊乱；各给药组小鼠脾脏指数均较模型组升高，脾脏形态有所恢复，提示机体免疫功能改善，其中再障膏方与环孢素联合应用效果更好。

综上所述， 环孢素与再障膏方合用较二者单用能更好地促进再生障碍性贫血小鼠血象恢复，能更明显改善Treg/Th17细胞比值异常及脾脏功能。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。