乌司他丁基于高迁移率族蛋白B1/ Toll样受体4/核因子-κB通路对急性胃肠损伤家兔肠屏障功能保护机制

花然亮， 徐 鑫， 李素彦， 吕 畅， 李 剑

河北省人民医院 急诊科，河北 石家庄 050051

严重多发伤能够导致创伤组织功能障碍，易诱导相邻器官出现继发损伤[1]。胃肠道是严重多发伤后以产生损害的器官之一，对缺血缺氧敏感，易导致急性胃肠损伤(Acute gastrointestinal injury,AGI)[2]。严重多发伤后AGI患者临床主要表现胃潴留和腹内高压等消化系统反应。胃肠功能屏障具有保护肠道功能，屏障受损时，毒素和病原菌进入血液系统，发生肠道病原菌移位，波及周围器官，产生继发感染。因此，保护严重多发伤后AGI患者胃黏膜屏障功能对于减少多器官衰竭和死亡有重要意义[3]。AGI发生时大量炎症细胞因子聚集此处，高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是具有保守性的蛋白因子，在多种炎症刺激下表达上调，在炎症反应及肠黏膜屏障损伤中发挥作用。肺损伤、肝损伤模型大鼠Toll样受体4(toll likereceptors 4,TLR4)能通过增加中性粒细胞表达而加重炎症损伤[4]。核因子-κB(nuclear facto-κB，NF-κB)能诱发炎症反应。乌司他丁属于糖蛋白，具有清除机体炎症、减少机体免疫损伤、保护人体器官、调节机体平衡的作用，临床应用于急性胰腺炎、创伤性休克，同样也应用外科手术及肿瘤治疗中减少肾功能损伤[5]。乌司他丁能够改善脑出血AGI患者肠黏膜功能，缓解病情，但在严重多发伤合并AGI中对肠道屏障及HMGB1/TLR4/NF-κB通路的影响研究较少。本研究旨在探讨乌司他丁基于HMGB1/TLR4/NF-κB通路对急性胃肠损伤家兔肠屏障功能的保护机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 乌司他丁购自常州天普制药有限公司(国药准字：H19990131)，丙氨酰谷氨酰胺购自珠海经济特区生物化学制药厂(国药准字：H20060344)，兔抗鼠 HMGB1、TLR4、NF-κB抗体购自美国 Santa Cruz 公司，多聚甲醛购自济南创世化工，生化实验电泳蛋白仪购自中国上海知信，Leica VT1000 S振动式切片机购自北京悦昌行科技。

1.2 实验动物与建模 家兔40只，购自中国重庆威斯腾生物，体质量2.0～2.5 kg，3～5月龄，按照实验动物规则饲养2周。动物一般情况及精神状态良好，设对照组10只，其余30只建立模型，建模前禁食12 h，禁饮6 h。自行设计重力牵引模仿交通意外导致损伤，家兔采用1.5%戊巴比妥纳进行耳缘静脉麻醉，固定于碰撞车后座椅之上，单轨时进行对撞损伤，双轨时进行侧撞损伤。保持自然坐姿，启动模拟损伤。损伤后立即送至动物检查室，采用CT对动物创伤程度进行评估，对照组不参与损伤建模。对家兔严重多发伤6 h后进行AGI评估，评估参照《欧洲危重病医学会关于AGI的定义和处理指南(2012)》[5-6]，家兔全部建模成功。将30只建模动物分为损伤组、药物对照组和干预组，每组10只。药物对照组建模成功后腹腔注射1.2 /kg的丙氨酰谷氨酰胺，8 h一次，连续7 d；干预组腹腔注射10万U/kg的乌司他丁，8 h一次，连续7 d。其余家兔同部位注射等体积生理盐水。

图1 各组小肠病理形态比较(HE染色×200；a.对照组；b.损伤组；c.药物对照组；d.干预组)

1.3 观察指标 最后一天注射后，检查4组家兔的肠脂肪酸结合蛋白(intestinal fatty acid binding protein，IFABP)、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、D 乳酸(D-Lactate，D-Lac)、降钙素原(procalcitonin，PCT)及C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)。比较丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)等血清氧化应激指标。

1.4 标本提取及免疫印迹检测 血液指标检测完成后，耳缘静脉空气栓处死家兔，无菌条件下，取回盲部15～20 cm组织，石蜡切片5 μm后，除蜡处理进行乙醇脱水。苏木精染色冲洗3次后，伊红染色5 min，显微镜观察肠道组织形态。

1.5 逆转录-聚合酶链反应检测小肠组织HMGB1、TLR4、NF-κBmRNA 小肠组织加入胰蛋白裂解液，离心后采取上清液加入样孔。进行电泳，缓释剂及磷酸盐缓冲溶液处理后，分别加入兔抗鼠1抗HMGB1(1∶600)、TLR4(1∶800)及NF-κB(1∶600 )，24 h后加入抗兔免疫球蛋白G二抗(1∶1 000)，杂交5 min采用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次后检测，获取图象，目的基因以β-actim为内参。各组小肠组织进行裂解，提取细胞重悬液，冲洗后放于无菌试管管中，采用TRIzol试剂提取RNA，逆转录为DNA进行逆转录-聚合酶链反应扩增。反应条件：98℃ 6 min，98℃28 s，75℃ 30 s，80℃ 4 min，总计55个循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 各组血清肠黏膜屏障及炎症指标比较 3组进行对撞损伤的家兔血清肠黏膜屏障指标IFABP、DAO、D-Lac和炎症指标PCT、CRP均高于对照组，药物对照组和干预组的上述指标均低于损伤组，且干预组低于药物对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清肠黏膜屏障及炎症炎症比较

2.2 各组血清MDA、SOD水平比较 3组进行对撞损伤的家兔血清MDA高于对照组，药物对照组和干预组的MDA均低于损伤组，且干预组MDA低于药物对照组；3组进行对撞损伤的家兔血清SOD低于对照组，药物对照组和干预组的SOD均高于损伤组，且干预组SOD高于药物对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组血清MDA、SOD比较

2.3 各组家兔小肠病理形态比较 对照组，小肠绒毛上皮及隐窝结构正常，绒毛致密，未见炎症浸润。损伤组，肠绒毛肿胀、脱落及水肿，小肠隐窝存在，黏膜下大量炎症细胞浸润。药物对照组，肠绒毛肿胀减轻，水肿好转，黏膜下浸润减轻。干预组，肠绒毛数量增多，长度增高，腺体增多，隐窝恢复正常。见图2。

图2 各组家兔HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达

2.4 各组HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白及mRNA表达 3组进行对撞损伤的家兔HMGB1、TLR4、NF-κB等蛋白及mRNA均高于对照组，药物对照组和干预组的上述指标均低于损伤组，且干预组低于药物对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、表4。

表4 各组HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白及mRNA比较

3 讨论

严重多发伤是一种死亡率较高的急危重症，治疗过程中常伴机体感染，诱发多器官功能不全。当发生严重多发伤时，胃肠急性缺氧、缺血症状显著，是易受到损伤的器官之一。严重多发伤可合并产生AGI，胃肠功能损伤，影响患者预后[6]。谷氨酰胺是人体必需氨基酸，能够显著提高AGI患者胃肠道黏膜功能，为应激状态下的肠黏膜细胞提供必需的能量，促进肠黏膜细胞增殖，为分泌型免疫球蛋白的浆细胞提供能量，减少肠道细菌对肠黏膜的附着，保护肠道免疫系统功能，减少肠黏膜细胞的过度凋亡，保护肠黏膜上皮形态完整。

IFABP与机体肠道黏膜功能密切相关，属于分子量较低的胞液蛋白，在全身代谢运转中发挥关键作用。IFABP在肠黏膜中表达较为丰富，但黏膜层对缺氧缺血较为敏感，当发生AGI时，炎症细胞聚集肠道黏膜下层，IFABP早期释放表达上调，增加肠道细胞膜通透性，大分子物质穿过细胞膜损伤肠道黏膜屏障功能，通过检测血清IFABP能够提高诊断AGI的准确性[7]。在正常机体中，DAO表达极低，AGI大鼠机体肠黏膜功能降低，DAO在肠道黏膜中表达下调，而随着坏死细胞进入肠道内，导致肠道组织中DAO含量升高，其活性变化可作为早起检测AGI患者肠黏膜损伤有效指标之一[8]。在AGI患者血清D-Lac表达升高，主要聚集在肠道，肠黏膜损伤后，屏障功能降低，D-Lac表达升高能够较好反应肠黏膜通透性改变情况。AGI不仅能够导致肠黏膜功能降低，还诱发全身炎症指标增加。PCT在机体受到外环境内毒素和病原菌侵犯时，含量升高诱发全身炎症反应。CRP属于非特异性炎症标志因子，能够参与机体多个疾病发生、发展。在AGI患者血清内表达上调，在肠道损伤部位聚集，降低黏膜屏障功能。AGI疾病氧化还原系统存在紊乱，导致肠上皮细胞抗氧化能力降低，增加DNA损伤。AGI大鼠中存在MDA、SOD水平异常表达，MDA表达升高，SOD水平降低[9]。乌司他丁具能够显著清除内源性氧化应激，具有保护黏膜屏障功能作用。机制在于能够通过抑制糖等脂类水解，稳定黏膜结构[10]。初期AGI患者黏膜出现存在不同程度缺血，乌司他丁治疗后血清中肠黏膜屏障指标IFABP、DAO、D-Lac表达降低，采用黏膜高通透性状态，具有保护黏膜屏障功能作用[11]。乌司他丁是能抑制炎症细胞内活性物质的糖蛋白，减少PCT、CRP对肠道黏膜的损伤，改善氧化损伤[12]。有研究表明，乌司他丁能够遏制PCT、CRP表达而缓解急性胃肠损伤病情。本研究表示，药物对照组和干预组血清肠黏膜屏障指标物和炎症指标均降低，干预组效果更显著，说明乌司他丁可以保护肠黏膜屏障功能[13]。

HMGB1是高度保守性的核蛋白，参与细胞DNA重组及修复[14]。AGI损伤后，HMGB1随肠上皮细胞的脱落分泌到细胞外，发挥促炎作用[15]。AGI疾病大鼠内毒素表达升高，提高HMGB1释放，与TLR4结合，加快NF-κB磷酸化，激活HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA信号通路表达。AGI患者TLR4能够激活TAK信号通路，介导细胞因子释放，参与肠道黏膜损伤，诱导全身炎症反应[16]。AGI大鼠肠道组织中NF-κB表达上调，肠道缺血缺氧能够激活NF-κB，加重感染。有研究表明，NF-κB及下游细胞因子表达激活能够加快肠黏膜损伤，增加细菌移位，与肠黏膜结构损伤存在正相关[17]。有研究表明，在AGI大鼠肠道组织中发现HMGB1、TLR4、NF-κBmRNA表达升高，与健康大鼠相比，该信号通路能够通过介导炎症及氧化应激指标参与黏膜损伤[18]。乌司他丁临床广泛用于抗烧伤及休克，，本研究干预组采用乌司他丁灌胃后肠道组织中HMGB1、TLR4、NF-κBmRNA表达降低，其机制可能在于乌司他丁抑制肠道细胞因子活性，降低IFABP、DAO、D-Lac等指标对肠黏膜的损伤，降低氧化刺激，下调HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表达，从而改善机体损伤。这与相关研究结果类似[19-20]。

综上所述，乌司他丁能够提高AGI家兔肠屏障功能，改善炎症及应激，其作用机制与抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关。