牡丹皮提取物抑菌性能及其在漱口水中的应用研究

胡永志 黄柳云 李江平 韦玉金 梁莹莹

(柳州两面针股份有限公司，545001)

据统计，我国人群口腔患病率达80%以上，并已威胁到各个年龄的人群，口腔护理迫在眉睫。常见的口腔问题包括龋病、牙周炎等。具相关研究显示，口腔菌属的分类也较细, 以厌氧菌为多。其中，龋病的主要致病菌为变形链球菌，是造成龋齿的主要原因；牙周炎的主要致病菌为牙龈卟啉单胞菌，其可能作为内源性致病菌在特定条件下过度生长而导致牙周破坏，同时也是口臭主要致病厌氧菌，甚至是成人失牙的主要原因。这些口腔问题的存在，会进一步破坏牙齿硬组织和牙齿周围支持组织，除影响咀嚼、言语、美观等功能外，还会引起社会交往困难和心理障碍；甚至有些微生物长期存在于口腔中，可导致或加剧某些全身疾病如冠心病、糖尿病、胃病等，危害全身健康，影响生命质量。

要预防口腔疾病最简单有效的方法是注意口腔卫生。选择合适的口腔护理产品可以有效地控制口腔有害细菌增长，使我们在日常生活中轻松地预防口腔疾病的发生。植物是传统医学的天然药物的重要来源，来源于植物的抗菌物质受到了广泛关注。例如，由植物牡丹皮提取的丹皮酚，相比之下更安全，毒副作用和刺激性更小，不易引起人体微生态系统失调的状况。

当前，人们在日常生活中清洁口腔时使用频率最高的即为牙膏和漱口水，且漱口水近年来在人群中的消费势头越来越高，使用频率也逐年增加。故本实验选用漱口水作为配方基底，添加植物牡丹皮提取的丹皮酚，通过分析其对变性链球菌、牙龈卟啉单胞菌的MIC值，以及对细菌细胞生长曲线抑制性能的研究，结合漱口水中保湿剂、增溶剂、香精等基底配方研究，开发出具有抑菌性能的植物漱口水。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

丹皮酚：本实施例采用的牡丹皮提取物，是牡丹皮原药经水蒸气蒸馏提取后，抽滤后得到粗结晶，再按照粗结晶∶95%乙醇∶纯化水=1∶4∶15的比例，对粗结晶进行纯化，0℃冷却静置48h，析出针尖状结晶且含量>90%的丹皮酚成分。

菌种：牙龈卟啉单胞菌(ATCC 33277)、变形链球菌(ATCC 25175)标准菌种，由广东省微生物分析检测中心提供。

培养基：BHI液体培养基、BHI固体培养基，广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液体培养基除氧

在培养基配置时，添加厌氧指示剂刃天青，液体培养基含氧时指示剂变粉红色，低氧至无氧时无色；使用99.99%纯度氮气进行培养基充氮除氧，以0.1～0.15L/min，30min的流速和时间进行充氮处理，经过高温灭菌后所得低含氧或无氧的BHI液体培养基。

1.2.2 最小抑菌浓度(MIC)

菌悬液的制备：将试验菌48h BHI液体培养物用除氧液体培养基稀释，制成所需菌悬液(要求的浓度为：用加样器取1μL～2μL菌悬液点种于固体培养基的表面，接种后所形成的菌液圈直径约为5mm～8mm，每点菌液圈回收菌数为1×104～9×104cfu/mL)。

采用琼脂稀释法以及点种法，进行对倍稀释，测试5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、浓度下丹皮酚的最小抑菌浓度。以不含丹皮酚成分的BHI固体培养基平板作为对照组，最后将点种有菌液的平板放置于厌氧袋中，37℃下厌氧培养18～24h，菌落生长被完全抑制的最低抵抗菌液浓度为该样品的对受试菌的MIC值。

1.2.3 抑菌实验

采用细胞生长曲线监测法进行抑菌效果测试。以漱口水中丹皮酚有效含量值配制成细菌培养液，作为试验组；以不含丹皮酚的细菌培养液，作为对照组，35℃～37℃培养，厌氧条件下，每间隔1小时，利用紫外分光光度计测定一次OD值，代表测试细菌浓度及生长情况。其中，牙龈卟啉单胞菌(ATCC 33277)测定波长为450nm，变形链球菌(ATCC 25175)测定波长为600nm。样品组生物生长曲线低于对照组生物生长曲线，标识为在该浓度下对细菌生长起到抑制作用，具有抑菌效果。

2 结果与讨论

2.1 最小抑菌浓度(MIC)试验结果

经实验发现，丹皮酚不能完全溶解于培养基中，会有晶体析出。故在进行实验前先用一定浓度的乙醇对丹皮酚进行溶解、稀释。首先测定乙醇对牙龈卟啉单胞、变形链球菌的MIC值，再确定该浓度下丹皮酚的溶解度，最后使用低于其MIC值并能完全溶解丹皮酚的乙醇浓度作为溶剂，以消除乙醇对丹皮酚抑菌效果的影响。

由表1可知，乙醇浓度<5%时，对牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌无抑菌作用；浓度为4%～5%时，能完全溶解相应浓度丹皮酚。故选择4%～5%浓度的乙醇作为丹皮酚在固体培养基的溶解剂进行丹皮酚MIC实验。由表2可知，丹皮酚对供试菌牙龈卟啉单胞菌的抑菌MIC值范围为0.625～1.25mg/ml，对供试菌变形链球菌的抑菌MIC值范围为1.25～2.5mg/ml。

表1 不同浓度乙醇对牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌的MIC值

表2 不同浓度丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌的MIC值

2.2 抑菌漱口水配伍研究及抑菌效果

2.2.1 抑菌漱口水配伍研究

甘油、泊洛沙姆、薄荷脑等原料在口腔护理产品中已经广泛运用，并且类似于甘油等保湿剂显示出一定的抑菌活性[1]。现将丹皮酚与漱口水基底配方进行配伍性能研究，在保证抑菌活性的同时，可保证漱口水自身的稳定性。

将丹皮酚与漱口水基底配方进行不同梯度配伍，在不引起漱口水理化指标改变的同时，从成本、口感等方面考虑，确定丹皮酚添加比例为0.05% ～0.25%，配制成植物抑菌漱口水。

表3 丹皮酚抑菌漱口水配方组成

2.2.2 抑菌实验结果

鉴于所提取的丹皮酚对受试菌的MIC值测试结果，所制得植物抑菌漱口水的抑菌效果分别如图1和图2所示。可以发现，实施例1中，所含丹皮酚有效含量值，对牙龈卟啉单胞菌的生物细胞生长曲线具有明显的抑制效果；对变形链球菌的生物细胞生长曲线有抑制效果，能降低其繁殖速率及生长时间。实施例4中，所含丹皮酚有效含量值，均对牙龈卟啉单胞菌以及变形链球菌的生物细胞生长曲线具有明显的抑制效果。

图1 丹皮酚对的牙龈卟啉单胞菌抑菌试验结果

图2 丹皮酚对的变形链球菌抑菌试验结果

3 结论

本研究对由植物牡丹皮提取的含量>90%的丹皮酚进行了MIC值测试，以及与漱口水基底复配后有效含量值的抑菌效果分析。结果显示：牡丹皮提取物丹皮酚，对牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌显示出具有一定的抑菌活性，对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用优于对变形链球菌的抑菌效果；其中：丹皮酚对供试菌牙龈卟啉单胞菌的抑菌MIC值范围为0.625～1.25mg/ml，对供试菌变形链球菌的抑菌MIC值范围为1.25～2.5mg/ml。将丹皮酚按0.05%～0.2%的比例添加到漱口水基底配方中，发现抑菌效果随丹皮酚含量的增加而增高，显现出较强的抑菌性能，得到具有有效抑菌效果的抑菌漱口水。

植物抑菌漱口水，是性能安全、有效的含植物抑菌物的口腔护理产品，其在发挥抑制口腔有害菌的同时，减少耐药性的产生，能降低化学剂用量及刺激性，达到保障口腔清洁卫生健康、维护口腔微生态平衡的目的，符合并满足广大人民群众日常的迫切需求，该技术的市场应用前景广阔，必会受到广大消费者青睐。