不同丛枝菌根真菌促进资阳香橙幼苗生长研究*

2021-12-09李果果刘金华李铭燕李冬萍刘升球张金莲陈廷速

云南农业大学学报(自然科学) 2021年6期

李果果，刘金华，宋娟，李铭燕,4，李冬萍，刘升球，张金莲,6，陈廷速

(1.广西农业科学院园艺研究所，广西南宁 530007；2.浙江养生堂天然药物研究所有限公司，浙江杭州 310007；3.广西农业科学院微生物研究所，广西南宁 530007；4.广西小藻农业科技有限公司，广西防城港 538000；5.广西特色作物研究院，广西桂林 541004；6.厦门大学公共卫生学院，福建厦门 361102)

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是自然界中重要的土壤有益微生物，能与绝大部分陆生植物根系形成共生关系[1]。由于化学肥料和农药的大量使用，中国农田土壤理化性质及微生物系统正在急剧恶化，主要表现为土壤板结、肥力下降、有机质含量降低、盐渍化加剧和微生物活性下降，从而造成农作物产量和品质下降等一系列问题[2-6]。AMF在改善土壤生态方面发挥着重要作用，可以提高土壤pH值，增加土壤中有机质含量，影响宿主植物的根系生长，促进宿主植物的营养吸收以及增强植物的抗逆性[3,7-12]。因此，研究AMF在农业生产中的应用具有重要的生态学和经济学意义。

柑橘是菌根植物，土壤AMF与柑橘根系建立共生关系[13-14]。柑橘在田间栽培下依靠菌根促进根系对土壤养分和水分的吸收，增强抗逆性[15]。不同生态型AMF菌株在柑橘上的表现有差异[16]，且AMF对不同宿主植物有偏好性，宿主植物的种类会在很大程度上影响丛枝菌根的生长发育[17]。资阳香橙 (Citrus junossiebSieb.ex Tanaka)为地方柑橘资源，是宜昌橙与宽皮橘的天然杂种，由于其具有抗碱、抗旱、与多数柑橘品种嫁接亲和、适应性强、早果性和丰产稳产性好等优点常用作柑橘砧木[18]。近年来，广西大规模种植杂交柑品种(如沃柑和茂谷柑)，面积达13.5万hm2，带动了广西柑橘产业的发展，其多采用资阳香橙为砧木。本研究以资阳香橙盆栽幼苗接种不同的AMF菌株，筛选促进植株生长明显的优势菌株，为菌根柑橘种苗的应用奠定基础，也为利用菌根柑橘种苗抑制柑橘黄龙病探索新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为柑橘砧木资阳香橙幼苗；供试花盆为新购置花盆，盆口直径 15 cm、盆高 12.5 cm、底部直径11 cm；供试基质为育苗有机质∶沙∶土按体积比2∶1∶1混匀后装入灭菌袋中进行高压蒸汽灭菌，温度121 ℃，时间120 min。

供试AMF菌株(表1)为广西农业科学院微生物研究所土壤微生物课题组前期从广西土壤分离、纯化和保藏的菌株。经由三叶草扩繁后获得，孢子密度为20～100 个/g。

1.2 方法

1.2.1 植株种植

供试资阳香橙种子由1‰高锰酸钾灭菌2 min、28 ℃培养箱催芽后在穴盘播种，发芽后选取高10 cm、生长一致的植株移栽于花盆。先在花盆底部垫1张与底部大小一致的纸片，加入1/2已灭菌的基质。按照每盆300个孢子的接种量，在植株根部周围放置AMF接种体，使其与根系充分接触，继续加入基质至花盆的3/4，同时保证基质没过根系，按菌株代码挂上标签。另设置1个对照组，共16个处理，每处理15盆，共240盆，每14 d淋1次Hoagland营养液。

1.2.2 测定指标

经过120 d生长后，测量不同AMF菌株处理后资阳香橙植株的茎粗、株高、叶片数和叶绿素含量。叶绿素含量用叶绿素SPAD值表示，利用叶绿素仪SPAD-502 Plus测量所得。

1.2.3 根系菌根染色

参考王幼珊等[19]的方法并略作改进。将资阳香橙植株根系剪为长约1 cm的小段，放入组织包埋盒中，加 20% KOH，90 ℃水浴0.5 h，清水冲洗3次；加入碱性 H2O2脱色2 h，清水冲洗3次；加5% 冰乙酸酸化2 h；加5%墨水醋染液，66 ℃水浴染色1 h；用清水漂洗3～5次，用清水浸泡12 h以上脱色，确保脱除植物组织颜色、保留菌丝等组织的颜色，以备测定侵染率。

1.2.4 根系菌根侵染率测定

菌根侵染率按照王幼珊等[19]的方法，每处理取30条根系观察不同AMF对资阳香橙根系侵染情况。使用尼康Eclipse Ci-L和DS-Ri2在显微镜下检查每条根段的侵染情况，按1,10,20,……,100逐等级打分，如：没有菌根结构的根段记为0，只有一半长度被侵染的根段记为50，全部被侵染的根段记为100。记录各等级下根段的条数，根段条数与其等级乘积之和除以总根段数即为该样品的侵染率。

1.3 数据分析

数据采用DPS v18.10软件进行方差分析，并进行Duncan’s多重比较以分析不同AMF菌株处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同AMF对资阳香橙根系侵染率

由表2可知：供试的15株菌株均可对资阳香橙根系造成侵染，平均总侵染率为50.97%，其中14株供试菌株的侵染率大于10%，仅菌株AD的侵染率为8.57%。15株供试菌株中，观察到根外菌丝、根内菌丝、泡囊、丛枝、菌丝圈和侵入点的占比分别为93.33%、100.00%、80.00%、100.00%、20.00%和40.00%。对照组(CK)未观察到真菌侵染的情况。菌株侵染资阳香橙的根外菌丝、根内菌丝、泡囊结构及丛植结构的染色图像如图1所示。

图1 AMF侵染资阳香橙根系Fig.1 The infection of AMF in Ziyang Xiangcheng roots

表2 资阳香橙接种不同AMF的根系侵染情况Tab.2 The infection in the roots of Ziyang Xiangcheng with different AMF

2.2 不同AMF菌株对资阳香橙生长的影响

2.2.1 对株高的影响

由图2可知：对照组植株株高为30.57 cm，15株菌株处理后植株的平均株高为36.90 cm。其中，菌株CE、FM、RF1、SV、RI和GS处理的植株株高均显著高于对照组(P<0.05)，菌株AD和AE处理的植株株高显著低于对照组 (P<0.05)，其他处理组的株高与对照组无显著差异(P>0.05)。

2.2.2 对茎粗的影响

由图2可知：对照组植株茎粗为2.63 mm，15株菌株处理后的植株平均茎粗为2.88 mm。其中，菌株CE、RI、FM、SV和RF1处理的植株茎粗均显著高于对照组 (P<0.05)，菌株AD处理的植株茎粗显著小于对照组 (P<0.05)，其他处理组的茎粗与对照组无显著差异(P>0.05)。

2.2.3 对叶片数的影响

由图2可知：对照组的叶片数为26.65，15株菌株处理后植株的平均叶片数为27.18。其中，菌株CE、FM、SV、GS和AR处理的植株叶片数均显著高于对照 (P<0.05)，菌株AE和AD处理的植株叶片数显著少于对照(P<0.05)，其他处理组的叶片数与对照组无显著差异(P>0.05)。

2.2.4 对叶绿素SPAD值的影响

由图2可知：对照组的SPAD值为57.66，15株菌株处理后植株的平均SPAD值为57.40。其中，菌株FM和CE处理的植株SPAD值显著高于对照 (P<0.05)，菌株AE和AD处理的植株SPAD值显著低于对照(P<0.05)，其他处理组的SPAD值与对照组无显著差异(P>0.05)。

图2 不同AMF菌株对资阳香橙生长的影响Fig.2 The effect on the plant growth of Ziyang Xiangcheng with different AMF

3 讨论

AMF与90%以上的陆生植物根系形成菌根共生体，促进了宿主植物水分和养分的吸收，可改善根系构型和增强宿主植物的抗逆性[1,15,20]。影响菌根与植物根系共生的主要因素是共生双方的生物学特性及其环境因子[21]。前人利用 4 种不同的AMF侵染洋葱，其侵染速度和侵染率有明显的差异[22]，说明不同菌株和宿主植物亲和性不同，同时环境因子(土壤酸碱度、理化性状和营养状况等)均可以影响菌根侵染状况。柑橘是中国南方重要的果树之一，其根毛少，属于典型的丛枝菌根植物，强烈依赖丛枝菌根对水分和养分的吸收功能[15]，从柑橘根系能清楚地观察到泡囊、丛枝、侵入点、根内菌丝、根外菌丝和根外厚垣孢子等结构[14]。不同柑橘品种或不同柑橘砧木对不同的菌根菌种具有明显不同的依赖性[23]。李艳等[24]研究表明：不同基因型柑橘接种摩西球囊霉后，菌根侵染率、土壤有效磷含量及土壤磷酸酶活性效应各不相同，但均以资阳香橙的菌根效应最强，其对摩西球囊霉的依赖性最强；吴强胜等[14]研究表明：国庆 1 号温州蜜柑/枳的菌根侵染率为16.01%～34.73%，国庆 4号温州蜜柑/枳的菌根侵染率为 20.65%～47.07%；邓溧[25]研究表明：柑橘种苗接种摩西球囊霉和幼套球囊霉后，根系菌根侵染率均达到60%以上。本研究利用从广西土壤中分离纯化获得的15株AMF接种资阳香橙种苗，其根外菌丝、根内菌丝、泡囊、丛枝、菌丝圈和侵入点的占比分别为93.33%、100.00%、80.00%、100.00%、20.00%和40.00%，根系菌根总侵染率超过70%的菌株包括SV、AR和RF1，侵染率为51%～70%的菌株包括RM、RI、RF2、CE和AS，仅菌株AD的侵染率为8.57%，其余6种菌株的菌根侵染率在20%～50%。

柑橘接种AMF能够改善根系构型，促进根毛发生，增加植物对水分和养分的吸收[26-27]，所形成的菌根可增加植株对H2O2的清除能力，显著增强柑橘抗旱性[28-29]。AMF通过诱导植物合成多种酶类、可溶性蛋白和类脂，并调节酶活性，平衡植物内源激素，促进水分和矿质养分的吸收利用，增强光合作用，以提高植物抗旱性、抗病性和其他抗逆性，增加产量和改善品质[30]。前人研究表明：幼套近明球囊霉(Claroideoglomus etunicatum)对柑橘[31]、玉米[32]和刺槐[33]有一定的促生效果；摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)对花生[34]、桑树[35]、烟草[36]、薰衣草[37]和郁金香[38]均有一定的促生或提高部分抗性效应。在本研究中，菌株CE和FM的菌根侵染率分别为58.93%和49.43%，能够显著促进资阳香橙的生长；菌株CE、FM和SV处理的资阳香橙株高、茎粗和叶片数均显著高于对照 (P<0.05)；菌株CE和FM处理的资阳香橙叶绿素SPAD值显著高于对照 (P<0.05)，说明菌株与寄主之间的亲和性与正效应不一定呈线性正相关。