叶酸对铝诱导的人神经母细胞瘤细胞活性氧和线粒体膜电位水平的影响*

曾智东,戚传娇,周艳华,谢 春

(贵州医科大学公共卫生学院/环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳 550025)

铝是人体的非必需元素，通过动物实验和流行病学调查发现铝可以引起学习记忆及认知能力障碍[1-2]。MIRZA等[3]在一个家族性阿尔茨海默病人群中利用荧光镓染色法发现了其前额叶皮层和顶叶皮层中的铝聚集，并且还观察到了β样淀粉蛋白斑块与铝的共定位。在体外实验中,铝能引起神经母细胞瘤细胞活性氧(ROS)水平的升高,并能扰乱细胞天然的抗氧化系统[4]。在动物实验中也发现铝能够穿过血脑屏障后分布到大脑皮层和海马域，诱导产生氧化应激并对膜脂、蛋白和抗氧化系统造成损伤[5-7]。在神经系统中铝元素的积累具有一定的毒性，而由铝引起的氧化应激可能是其产生毒性的一个重要手段。

叶酸也称为维生素B9，是人体内参与合成DNA和RNA的重要物质，其主要来源于新鲜的蔬菜、水果和肉类。众所周知叶酸可以预防新生儿的神经管畸形，母体中的叶酸水平与新生儿神经管畸形发病率密切相关，但叶酸是如何阻止神经管畸形的发生过程还未明确[8]。有研究发现，叶酸可以降低患者在进行血液透析过程中的氧化应激水平并增强血液的总抗氧化水平[9]，通过提高抗氧化能力及降低β样淀粉蛋白的形成，叶酸能通过增强高血压患者的心脏和血管中交感神经感受器的灵敏度来缓解病情[10-11]。本研究探讨叶酸对铝诱导的人神经母细胞瘤细胞活性氧(ROS)和线粒体膜电位(MMP)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞，中国科学院昆明野生动物细胞库)；硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化铝 (美国Sigma公司)；麦芽酚、叶酸(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM/Ham’s F-12(1∶1)培养基[生工生物工程(上海)股份有限公司];胎牛血清(美国Gibco公司);Cell Counting Kit-8、ROS检测试剂盒(DCFH-DA)、MMP检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；流式细胞仪(Coulter Cytomics FC500，美国Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

SH-SY5Y细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12(1∶1)培养基中，置于37 ℃、5% CO2、100%湿度的培养箱中培养，4～7 d传代1次。

1.2.2金属染毒

将氯化铝和麦芽酚分别配成浓度为20 mmol/L和60 mmol/L的溶液，将两种溶液等体积混合配制成终浓度为10 mmol/L的麦芽酚铝溶液过滤除菌后待用，铝离子染毒均使用相应浓度的麦芽酚铝(标记为Al)；将硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁利用去离子水分别配置成10 mmol/L溶液过滤除菌后待用，染毒分别用相应浓度Zn、Cu、Fe表示。

1.2.3叶酸干预

在含有10%胎牛血清的DMEM/Ham′s F-12(1∶1)培养基中分别配置叶酸终浓度为50、100、150、200 μmol/L的干预培养基，在此培养基中加入染毒金属母液后即用于处理细胞。

1.2.4细胞ROS水平检测

按照105个/孔SH-SY5Y细胞接种到12孔板中，然后加入相应浓度金属染毒相应的时间，每个染毒浓度和时间5个重复。根据说明书配置ROS检测荧光探针(DCFH-DA)工作液，染毒结束后收集所有重复孔的细胞，加入PBS洗涤1次，然后加终浓度为10 μmol/L的荧光探针(DCFH-DA)工作液500 μL并重悬细胞。37 ℃避光孵育30 min后加入PBS 2 mL洗2次，离心后加PBS 500 μL重悬细胞，加入流试管内，立即上流式细胞仪进行检测，每个染毒处理收集2×104～4×104个细胞的数据。(1)有报道显示环境相关金属(Zn、Cu、Al、Fe等)能在海马、大脑皮层等组织细胞中参与Aβ的生成过程[11]，所以使用100 μmol/L叶酸与100 μmol/L Zn、100 μmol/L Cu、100 μmol/L Al、100 μmol/L Fe共同处理SH-SY5Y细胞24 h后测定该细胞中的ROS水平。(2)使用100、200、300、400、500 μmol/L Al分别染毒SH-SY5Y细胞6 h后测定该细胞的ROS水平。(3)分别使用50、100、200 μmol/L叶酸干预300 μmol/L Al 诱导SH-SY5Y细胞6 h的ROS水平，对照分别有含有10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12(1∶1)培养基(control)、50 μmol/L叶酸处理及10 μmol/L叶酸通路阻断剂甲氨蝶呤(MTX)。

1.2.5细胞MMP水平检测

按照105个/孔SH-SY5Y细胞接种到12孔板中，然后分别加入300 μmol/L Al、50 μmol/L+300 μmol/L Al处理6 h，每个处理5个重复。根据说明书配置MMP检测荧光探针(JC-1)工作液，染毒结束后收集所有重复孔的细胞，加入PBS洗涤1次，用500 μL全培养基重悬，然后加荧光探针(JC-1)工作液500 μL颠倒混匀细胞。37 ℃避光孵育20 min后加入1 mL 预先4 ℃冷却的JC-1染色缓冲液洗4次，离心后加JC-1染色缓冲液500 μL重悬细胞，加入流试管内，立即上流式细胞仪激发光488 nm进行检测，每个染毒处理收集2×104～4×104个细胞的数据。

1.2.6细胞毒性测定

将2×104个/孔SH-SY5Y细胞接种到96孔板中，然后分别加入300 μmol/L Al、50 μmol/L叶酸+300 μmol/L Al处理24 h，每个处理5个重复。当染毒完成后再加入100 μL完全培养基，向每孔加入5 μL Cell Counting Kit-8溶液充分混匀，培养箱中继续培养2 h,酶标仪在450 nm处测定光密度(OD值)。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 叶酸干预各环境相关金属诱导的SH-SY5Y细胞ROS水平

Zn、Al、Fe金属离子诱导SH-SY5Y细胞均会不同程度提高ROS水平，叶酸可抑制由Al、Fe金属离子诱导的ROS水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。100 μmol/L Al诱导的DCF相对荧光值为141 080±92 424高于100 μmol/L叶酸+100 μmol/L Al组的DCF相对荧光值120 092±80 891，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 不同浓度Al诱导的SH-SY5Y细胞ROS水平

随着Al的浓度提高，SH-SY5Y细胞的ROS水平呈上升的趋势，300 μmol/L Al诱导的SH-SY5Y细胞DCF相对荧光值为11 959±6 233高于control组的7 388±3 642，差异有统计学意义(P<0.05)。但400、500 μmol/L Al诱导的SH-SY5Y细胞ROS水平却未升高，见图2。

A:control与叶酸处理流式细胞术检测峰图;B:Zn染毒及叶酸干预流式细胞术检测峰图;C:Cu染毒及叶酸干预流式细胞术检测峰图;D:Al染毒及叶酸干预流式细胞术检测峰图;E:Fe染毒及叶酸干预流式细胞术检测峰图;F:各金属改变SH-SY5Y细胞的ROS水平及叶酸干预作用流式细胞术检测结果比较;a：P<0.05，与control比较；b：P<0.05，与单金属处理组比较。

图2 不同浓度Al诱导的SH-SY5Y细胞ROS水平

2.3 不同浓度叶酸干预Al诱导的SH-SY5Y细胞ROS水平

50 μmol/L叶酸+300 μmol/L Al组细胞的DCF相对荧光值为15 926±8 200低于300 μmol/L Al组的DCF相对荧光值20 118±12 503，差异有统计学意义(P<0.05)。单独使用50 μmol/L叶酸处理并没有大幅改变SH-SY5Y细胞的ROS水平，见图3。

2.4 叶酸对Al诱导SH-SY5Y细胞MMP的影响

300 μmol/L Al组MMP降低的细胞(即进入A+-象限的细胞)比例为45.88%，而50 μmol/L叶酸+300 μmol/L Al 组为38.04%，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

2.5 叶酸对Al诱导SH-SY5Y细胞毒性的影响

300 μmol/L Al组细胞存活率为71.9%，而50 μmol/L叶酸+300 μmol/L Al 组为82.7%，见图5。

图3 不同浓度叶酸干预Al诱导的SH-SY5Y细胞ROS水平

A:control;B:300 μmol/L Al;C:50 μmol/L叶酸+300 μmol/L Al;D:各组MMP降低细胞比例比较;a：P<0.05，与control比较；b：P<0.05，与300 μmol/L Al比较。

图5 SH-SY5Y细胞的24 h增殖曲线

3 讨 论

叶酸作为常用的水溶性维生素之一具有一定的抗氧化的能力。金莉莉等[12]研究发现叶酸可以降低小鼠体内丙二醛(MDA)的水平，并且叶酸可通过升高血清中氧磷脂酶活性的同时降低髓过氧化物酶活性来发挥高密度脂蛋白的抗氧化和抗炎作用[13]。在临床幽门螺杆菌阴性的慢性萎缩性胃炎治疗中发现，增加叶酸的使用可提高患者的总抗氧化能力和谷胱甘肽氧化物酶活力，并降低患者血清中MDA的水平[14]。通过在子痫前期患者的治疗中增加叶酸和维生素B12，可提高患者体内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽氧化物酶的活力，并降低MDA水平[15]。叶酸具有改善老年H型高血压急性脑梗死患者认知功能障碍的作用，在使用氯沙坦改善认知功能障碍的同时加入叶酸能有效提高蒙特利尔认知评估量表和简易智能量表的评分，并降低神经元特异性烯醇化酶、中枢神经特异蛋白和Aβ等蛋白水平[16]。

阿尔茨海默病致病机制具有多种假说,而氧化应激可扰乱机体氧化与还原的平衡，并使得身体产生过多的ROS和活性氮，促使Aβ在脑部的沉积[17]。已有研究提示ROS与阿尔茨海默病的发生有密切关系，可能是阿尔茨海默病形成的重要因素[18]。而铝具有神经毒性可以引起神经细胞的死亡[19]，而ROS可以介导SH-SY5Y细胞的凋亡。Aβ作为阿尔茨海默病发生的另一个重要因素可引起中枢神经系统的慢性炎性反应[20]，而铝的存在有利于Aβ的生成，并且铝能降低机体清除氧自由基的能力，加速机体的氧化损伤[21]。

本研究发现，Al可以在较短时间内(6 h)诱导SH-SY5Y细胞的ROS水平上升，而叶酸可以在一定范围内降低Al所诱导的这种效应。虽然已有研究显示叶酸有一定的抗氧化功能[22]，但其是如何发挥抗氧化功能的还未有研究。而且ROS水平的上升可能导致细胞的线粒体膜通透性转运孔开放，并进一步导致MMP的降低，使得细胞产生的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)数量降低，最后引起细胞的存活率降低[23]。本研究显示，叶酸能降低Al对SH-SY5Y细胞的毒性，减少Al诱导SH-SY5Y细胞MMP降低的细胞比例，推测叶酸可能通过拮抗铝所诱导的ROS水平上升而促进MMP的恢复，这为后续研究叶酸抗氧化机制提供参考。