猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗的免疫效力研究

2021-12-09李少丽尹忠良张春阳斯琴高娃王家福

现代畜牧兽医 2021年11期

李少丽，尹忠良，张春阳，斯琴高娃，康斌，王家福

（杭州佑本动物疫苗有限公司，浙江杭州310018）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又称“猪蓝耳病”，是以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的1种急性、高度传染性的病毒性传染病。该病可引起妊娠母猪流产、早产、产死胎、产弱仔猪以及仔猪和生长育肥猪的呼吸困难、生长缓慢、高病死率[1]。该病的病原体，猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是1种正链小RNA病毒，属于动脉炎病毒科，直径50~65 nm，为1种有囊膜的病毒。PRRSV可分为美洲型和欧洲型2个基因型，我国分离到的基本为美洲型。

1996年，我国首次分离到PRRSV，命名为CH-1a[2]。2006年，我国多个省份的猪场出现由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引起的猪繁殖与呼吸综合征疫情，商品猪病死率超过50%，母猪病死率高达5%以上，造成100多万头猪死亡[3]。后续研究表明，在HP-PRRSV的Nsp2区有30个不连续氨基酸的缺失[4]。2012年，我国又出现新的与美国NADC30基因同源性较高的PRRSV毒株，命名为类NAD30。感染该毒株的母猪群流产率高达10%~50%，仔猪厌食、嗜睡、被毛粗乱、生长缓慢，耐过猪多数成为僵猪，给我国猪场带来巨大的经济损失[5-7]。通过对全国各地分离出的PRRSV变异株进行Nsp2基因序列的比较分析，结果显示，其Nsp2基因上均存在131个氨基酸的不连续缺失[8]。

近几年，类NAD30毒株感染呈现增高趋势，且与HP-PRRSV成为我国猪群蓝耳病的两大主要病毒类型[9-10]。PRRSV易变异及重组的特性导致疫苗毒力返强现象频发，尤其是类NAD30易与疫苗毒及田间野毒发生重组。当前很多猪场存在PRRSV田间野毒株、疫苗毒株以及田间野毒株与疫苗毒的重组毒株等现象，PRRSV种类呈现多样化[11-12]。研究人员陆续从发病猪场分离到PRRS疫苗毒与野毒重组的毒株，开始担心PRRS弱毒疫苗安全性[13]。然而，类NAD30与目前流行的PRRSV疫苗株之间的基因组相似性只有85.5%~89.5%，导致商业疫苗对当前流行的类NAD30交叉保护较弱，免疫经典或HP-PRRSV疫苗的猪场均发生类NAD30毒株感染的现象，提示现有的商业化PRRS疫苗不能对猪产生足够的免疫保护。

因此，应该开发与PRRSV流行毒株同源性更高且安全性更好的灭活疫苗，与PRRS活疫苗联合使用，降低猪群发病率，保持生产成绩的稳定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PRRSV ZJ/H（HP-PRRSV）和ZJ/NB（类NAD30）毒株、Marc145细胞、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）以及猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（CH-1a株）。

1.2 试验方法

1.2.1 猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗的制备

对制备的PRRSV抗原液BEI灭活，与水包油佐剂按3∶1乳化，制备PRRS二价灭活疫苗（ZJ/H株和ZJ/NB株），进行安全检验和免疫效力研究。

1.2.1.1 制苗用病毒液的制备

取生长良好的单层Marc145细胞，弃掉旧培养液，按5%比例（V/V）分别接种PRRSV ZJ/H株和ZJ/NB株毒种，37℃、5%CO2培养箱内吸附1 h后，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液继续培养。待80%细胞出现聚堆、脱落时收获病毒液，冻融2次，-70℃保存。

1.2.1.2 病毒抗原液半数感染量（TCID50）的测定

将抗原液使用无血清DMEM做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度，分别接种于96孔板中的单层Marc145细胞，每个稀释度接种6孔，0.1 mL/孔，各孔补加0.1 mL的含2%胎牛血清的DMEM维持液，在37℃、5%CO2培养箱观察5 d，按照Reed-Muench法计算TCID50。

1.2.1.3 疫苗用病毒液的灭活

将检验合格的病毒液分别加入终浓度为5 mmol/L的BEI灭活剂，37℃搅拌灭活24 h，加入5 mmol/L的硫代硫酸钠中和1 h，2~8℃保存。

灭活后，从每瓶病毒液中取样，10倍稀释后接种于已长成单层的Marc145细胞，每个样品接种4瓶，每瓶1 mL，加维持液培养，盲传2代，应无细胞病变出现。

1.2.1.4 乳化

将灭活后的2种病毒抗原按1∶1的体积比混合，按照病毒水相抗原与佐剂以质量比3∶1缓慢加入水包油佐剂，1 000 r/min搅拌20 min制成乳化剂。

1.2.2 猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗的安全试验

选择5月龄健康易感后备母猪5头（中和抗体效价小于1∶4），每头于颈部肌肉注射疫苗4 mL，观察14 d，记录临床症状。

1.2.3 猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗免疫效力试验（见表1）

表1 试验设计Tab.1 Test design

40头5月龄PRRSV抗原、抗体阴性的健康后备母猪（中和抗体效价小于1∶4）分为A~H 8个组。

A~F组先免疫商品化高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株），2 mL/头份。2 w后，C、D组免疫制备的猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗（ZJ/H株+ZJ/NB株），E、F组免疫商品化猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（CH-1a株）；A、B、G及H组免疫PBS，2 mL/头。

二免14 d后，所有试验猪按照试验分组情况使用ZJ/H株或ZJ/NB株攻毒（105.0 TCID50），每头滴鼻1 mL，于颈部肌肉注射2 mL，连续观察14 d后，所有存活猪安乐死。

根据试验猪的临床症状、中和抗体水平、攻毒前及攻毒后7、14 d的血清病毒载量和体重变化等，评价所制备猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗对后备母猪的免疫效力。

2 结果与分析

2.1 PRRSV ZJ/H和ZJ/NB株病毒抗原液含量测定

ZJ/H株和ZJ/NB株PRRSV病毒含量均不低于107.0TCID50/mL。

2.2 制苗用抗原液的灭活及检验

2种灭活后的PRRSV抗原液接种Marc145细胞盲传2代，均未出现细胞病变，表明灭活完全。物理性状检验等符合新版《中国兽药典》要求。

2.3 安全性试验结果

5头试验猪每头颈部肌肉注射疫苗4 mL，观察14 d，期间精神、食欲正常，未出现任何不良反应，接种部位未出现红肿现象，表明疫苗具有良好的安全性。

2.4 免疫效力试验结果

2.4.1 免疫及攻毒后的临床表现

A~F 6个组在疫苗免疫后精神、食欲均正常，无体温升高等不良反应。攻毒后，A~F 6个组猪全部存活，其中B、E、F组各有1头试验猪发病，发病猪体温升高，精神食欲下降，有咳嗽、气喘等呼吸道症状。G和H两个不免疫攻毒对照组猪全部发病，分别有2头和1头死亡。结果表明，PRRS活疫苗虽对ZJ/H免疫保护较好，但对ZJ/NB的攻击保护效率降低。若在PRRS活苗免疫后进行PRRS二价灭活疫苗的加强免疫，攻毒后未出现任何肉眼可见病变，提示对猪提供良好的攻毒保护。

2.4.2 免疫及攻毒后中和抗体检测结果（见图1）

由图1可知，免后21 d所有组中和抗体均为阴性（小于1∶4），相比之下，C、D、E、F 4个灭活疫苗加强免疫组虽在首次免疫28 d后中和抗体仍较低，但在攻毒后第7 d中和抗体明显上升，其中最高的C组中和抗体效价达4.9 log2；攻毒后第14 d灭活疫苗加强免疫组中和抗体水平略有下降，仍明显高于其他试验组；F组疫苗毒株诱导血清对HZ/NB的中和能力差，所以与其他3个灭活疫苗加强免疫组相比，中和抗体效价偏低。

2.4.3 免疫及攻毒后血清病毒载量检测结果（见图2）

由图2可知，整个攻毒期间，C、D、E组均未检测到PRRSV，A、B、F组攻毒后血清病毒载量较低，约为101.3~102.2 copies/µL；G组和H组病毒载量较高，达到103.4 copies/µL以上。研究表明，与单独免疫PRRS活疫苗相比，PRRS灭活疫苗的加强免疫，尤其是免疫的同源性更高的PRRS二价灭活疫苗，可加速试验猪体内排毒、缩短排毒期、有效降低病毒在自然感染后环境中的病毒量。

2.4.4 免疫及攻毒后各组日增重变化（见图3）

由图3可知，攻毒后7 d所有免疫组试验猪的日增重均低于攻毒当天，其中C、D、E加强免疫组日增重降低不明显（小于15 g），A、B两组平均降低约167 g，G组和H组体重呈负增长。攻毒14 d后，A、B组试验猪日增重逐渐恢复正常，C、D、E及F组基本恢复至正常生长水平，而G、H两组存活试验猪仍未实现增重。研究表明，灭活疫苗的加强免疫对提高猪的日增重、缩短出栏天数提供保障。

3 讨论

本试验利用PRRSV ZJ/H株和ZH/NB毒株制备猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗，对所制备疫苗进行安全检验和效力免疫研究。结果表明，PRRS活疫苗与灭活疫苗的联合免疫，可产生比单独用PRRS活疫苗更高的中和抗体、更低的血清病毒载量并显著提高日增重。PRRS活疫苗与制备的PRRS二价灭活疫苗的联合免疫效果优于商品化的PRRS灭活疫苗（CH-1a株），单独使用PRRS活疫苗的免疫猪仍出现PRRS相关症状，表明与攻毒毒株同源性更高的毒株制备的疫苗具有更强的免疫保护效果。田间应用也表明，类NAD30易与PRRS活疫苗毒株或野毒株重组，导致猪场中PRRSV病毒类型多样化、猪病愈发复杂，应谨慎使用。PRRSV灭活疫苗安全性好，可提高免疫猪血清中和抗体效价[14]，应根据实际情况联合应用PRRSV活疫苗及灭活疫苗防控猪蓝耳病。

疫苗的免疫压力也是诱导PRRSV发生变异的重要原因[15]，要科学运用PRRS疫苗，配合良好的饲养管理及生物安全防控，以逐步实现猪场蓝耳病的免疫和无疫，最终达到净化的目标。