维药神香草的质量控制研究

韩雪 李莉 刁娟娟

【摘 要】 目的：建立神香草质量控制的方法。方法： 以迷迭香酸和蒙花苷作为指标成分，建立神香草鉴别和含量测定的方法，进行方法学考察。结果：高效薄层扫描法采用聚酰胺薄膜，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（2∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]1）展开剂，药材与各对照品在相同位置显相同颜色的斑点。二者线性关系（高效薄层扫描法： r1=0.9958、r2=0.99328，高效液相色谱法： r1=0.9999、r2=0.9997）;精密度、稳定性、重复性（RSD<5%）良好;通过生态量表分析高效薄层扫描法的数据极好的，高效液相色谱法是可接受的。说明高效液相色谱法和高效薄层扫描法均可作为神香草质量控制的检测方法。结论： 本研究建立的神香草质量控制方法稳定、重复性好，为神香草的质量控制提供实验依据。

【关键词】 高效液相色谱;高效薄层扫描;迷迭香酸;蒙花苷

【中图分类号】R284   【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2021）20-0016-06

Study on Quality Control of Hyssopus Officinalis

HAN Xue LI Li* DIAO Juanjuan

School of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China

Abstract：Objective To establish a method for quality control of Hyssopus officinalis.Methods With rosmarinic acid and mongoside as indicator components， a method for identification and content determination of Hyssopus officinalis was established， and the methodology was investigated.Results High performance thin layer chromatography scanning （HPTLCS） used polyamide film and dichloromethane-ethyl acetate-formic acid （2∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]1） as a developing agent. The medicinal material and each reference substance showed spots of the same color at the same position.The linear relationship between the two （HPTLCS： r1=0.9958， r2=0.99328， High performance liquid chromatography （HPLC）： r1=0.9999， r2=0.9997）; the precision， stability， and repeatability （RSD<5%） are good; the HPTLCS data analyzed by Ecological Scale Analysis（ESA） is excellent， HPLC is acceptable.It shows that both HPLC and HPTLCS can be used as detection methods for Hyssopus officinalis quality control.Conclusion The quality control method of Hyssopus officinalis established in this study is stable and reproducible， which provides experimental basis for the quality control of Hyssopus officinalis.

Key words：HPLC; HPTLCS; Rosmarinic Acid; Buddleoside

神香草為唇形科（Labiatae）神香草属（Hyssopus）硬尖神香Hyssopus cuspidatus Boriss.的地上干燥部分，主要分布在新疆阿勒泰等地，是新疆地区习用草药。《维吾尔药志》记载其“性二级热，味苦、辛，气芳香，具有温肺平喘、祛寒止咳、燥湿祛痰、发汗解毒、消炎退肿的功效，用于湿寒性和黏液质性呼吸病[1]”。研究[2-4]报道，神香草中富含挥发油、三萜、黄酮、酚酸、多糖等成分，被广泛应用于维药、中成药中。临床上，神香草多为感冒、咳嗽药方中的主药或辅药，还被制成祛痰剂、发汗剂等 [5]。

1999年《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》[6]收录神香草，其中包括了药材的外观性状、性味和功能主治等。该药材药用价值较高，但近年来药材购买市场较混乱，因为其极易与大苞荆芥混淆，所以建立质量控制的方法至关重要。前期已有学者对神香草和混淆品大苞荆芥进行了初步的质量标准研究[7]，选用三萜类代表成分齐墩果酸与熊果酸作为指标成分。

神香草为本课题组所研究的中成药罗欧咳祖帕的主药，主要应用其抗炎、抗氧化、抗哮喘的功效，前期药效研究[8-16]表明酚酸类与黄酮类成分是抗炎、抗氧化的主要活性部位。根据相关文献[17]报道，酚酸类化合物迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗哮喘的功能，可通过改善内源性抗炎机制，抑制炎症细胞的释放，从而改善哮喘症状。黄酮类化合物蒙花苷具有抗菌消炎功能，而大苞荆芥未见文献报道黄酮类化合物蒙花苷的存在。因此本课题组选择酚酸类化合物迷迭香酸和黄酮类化合物蒙花苷为指标成分，对不同产地的神香草药材进行定性定量分析。目前，大多采用高效液相色谱法测定其含量，鲜有报道高效薄层扫描法对神香草中有效成分进行定量分析。高效薄层扫描法具有定性定量、操作快速、简单、成本低廉的优点[18-19]。本实验在对神香草进行质量控制的同时，并采用生态量表（ESA）对实验过程中环境友好程度进行对比分析[20-22]，以期为神香草中迷迭香酸和蒙花苷的质量控制和含量测定提供依据。

1 材料

1.1 药材与试剂 神香草采购自新疆和田地区，由新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为硬尖神香草。共有五批样品：S1（20110719）， S2（1911044）， S3（1909026）， S4 （1910039）。生药学图片如图1所示。迷迭香酸（批号：111871-201706，中国食品药品研究院）;蒙花苷（批号：20210606，北京索莱宝科技有限公司）;乙腈（色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司）;甲醇，磷酸，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲酸（分析纯）;聚酰胺薄膜（20 cm×10 cm，浙江台州路桥四甲基生化塑料厂）。

1.2 仪器 高效液相色谱仪（日本岛津，LC-20AT）;TLC扫描仪3、Reprostar 3薄层色谱、Linomat5半自动点样仪均来自CAMAG（瑞士）;数控超声波清洗器（KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司）;电子天平（AL104，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）;分析天平（AB135-S，d=0.01/0.1mg，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）

1.3 高效液相色谱法

1.3.1 对照品溶液配制 精密称取迷迭香酸10 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到迷迭香酸对照品储备液;精密称取蒙花苷5 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到蒙花苷对照品储备液。

1.3.2 供试品溶液配制 精密称定神香草粉末0.5 g（过筛），置于具塞锥形瓶中，加入25 mL80%甲醇，称定其质量，超声（500 W、40 KHz）提取30 min，放冷后再称定质量用溶剂补足重量，合并滤液，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.3.3 高效液相色谱条件 色谱柱：Sepax HP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;等度洗脱：乙腈-0.1%磷酸（25∶[KG-*3/5]75）;检测波长：330 nm;流速：1 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。如图2所示。

1.4 高效薄层扫描法

1.4.1 对照品溶液配制 精密吸取“1.3.1”项下对照品储备液经稀释分别得到迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液。

1.4.2 供试品溶液制备 精密称定神香草粉末1.0 g（过筛），置于具塞锥形瓶中，加入15 mL甲醇，称定其质量，超声（500 W、40 KHz）提取30 min，放冷后再称定质量用溶剂补足重量，合并滤液，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.4.3 薄层层析及薄层扫描条件 聚酰胺板（20 cm×10 cm），条状点样，点样量为3 μL，试验前置110 ℃电热恒温鼓风干燥箱中活化20 min后，在干燥環境中放冷，以二氯甲烷∶[KG-*3/5]乙酸乙酯∶[KG-*3/5]甲酸=2∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]1为展开剂，双槽展开缸中饱和15 min，展开，取出，晾干，以2%三氯化铝溶液显色，105 ℃加热5 min，置于366 nm紫外灯下检视。在200～700 nm全波长下进行直线扫描检测，狭缝宽度为6 mm×0.3 mm，扫描速度为20 mm/min。使用了氘灯。测量供试品吸光度积分值和对照品吸光度积分值并计算。如图3～4所示。

2 方法与结果

2.1 线性范围 使用半自动点样仪分别吸取迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液，以点样量0.5、1、1.5、2、2.5、3 μL分别点于聚酰胺板上，按照“1.4.3”项下的色谱条件展开、扫描。对照品储备液经倍半稀释法得到系列溶液。根据“1.3.3”项下的色谱条件下测定峰面积，以质量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程。见表1。

2.2 精密度试验 将迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液分别点在同一聚酰胺板上（2 μL， n=6），按照“1.4.3”项下的色谱条件连续测定3 d。在3 d内，根据“1.3.3”项下的色谱条件，每天重复测定6次标准溶液。用相对标准偏差（RSD）计算了两种方法的日间和日间精度。见表2。

2.3 稳定性试验 供试品溶液（1911044）点于在同一聚酰胺板上（3 μL， n= 6），按照“1.4.3”项下的色谱条件展开。根据“1.3.3”项下的色谱条件，考察样品S2在0、2、4、6、8、12、24 h内的稳定性。两种方法的相对标准偏差（RSD）值计算。见表3。

2.4 重复性 精确称量同批次（1911044）样品6份，分别按照“1.3.2”和“1.4.2”项下的方法制备样品溶液，在“1.4.3”项下的色谱条件下，将样品溶液点在同一聚酰胺板上。根据“1.3.3”项下的色谱条件对供试品溶液进行检测。两种方法的相对标准偏差（RSD）小于3.00%，表明本方法重复性良好。

2.5 加样回收率 首先，分别按照“1.3.2”和“1.4.2”项下的方法平行制备供试溶液，测定迷迭香酸和蒙花苷的含量。将待测溶液按比例1∶[KG-*3/5]1加入对照品溶液，按“1.4.3”项下色谱程序进行点样、显色、扫描。同样的供试品溶液按对照品0.5∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]1.5的比例加入，在“1.3.3”项下的色谱条件下用高效液相色谱法检测。计算两种方法的样品回收率和相对标准偏差（RSD）。见表4、5。

2.6 含量测定 在相应的色谱条件下，分别采用HPTLCS和HPLC法测定4批神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量，并计算不同方法测定的含量。对比两种方法测定神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量。见表6、7。

2.7 生态量表（ESA）分析 计算了两种方法分析的时间和试剂消耗。可以看出，采用HPTLCS检测神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量的时间和试剂消耗较少。见表7。根据PPs算法规则，对计算结果进行尺度排序，得分大于75代表绿色分析优秀，从75到50代表绿色分析可接受，小于50代表绿色分析不合格。结果表明，HPTLCS在分析生态尺度中得分较高。得分越高，说明该方法越环保、绿色。结果见表8。因此，可以看出HPTLCS是一种更经济、环保的分析技术。

3 討论

3.1 指标物选择 通过药效追踪确定抗炎的有效部位为酚酸类和黄酮类，结合相关研究暂定以酚酸类化合物迷迭香酸和黄酮类化合物蒙花苷为指标成分，指标成分的选择与药效息息相关，采用不同类指标成分和不同检测方法对神香草进行更全面的质量评价和质量控制研究。

3.2 薄层板选择 本研究在薄层鉴别时最初选用高效硅胶板，考察了多个展开剂发现蒙花苷始终无法显色，由于蒙花苷是黄酮类成分，所以将硅胶板换为聚酰胺薄膜。在紫外366 nm下显黄色斑点。

3.3 混淆品鉴别 由于市场中药材较混乱，神香草购买过程中多次出现混淆品大苞荆芥，所以本研究在建立神香草质量标准的同时，以相同的色谱条件和相同的指标成分对混淆品大苞荆芥进行鉴别、分析，结果显示，与神香草相比，大苞荆芥中迷迭香酸含量较低，无黄酮类化合物蒙花苷，因此可以采用该方法区分神香草与混淆品大苞荆芥，为保证药材正确性提供参考价值。

3.4 不同方法比较 高效液相色谱法与高效薄层扫描法相比，前者灵敏度高、结果更准确、稳定，但样品制备较复杂，费用高;后者具有操作简单、迅速的特点，虽然灵敏度稍低，但高效薄层扫描法可作为一个简单、快速的质量控制方法。通过二者实验对比，期望对建立神香草质量标准提供后期实验依据。

综上，本研究所建立的神香草定性、定量方法具有简便、可行、重复性好的特点，可为快速鉴别神香草提供科学依据，为完善、建立质量标准奠定基础。

参考文献

[1]尹龙萍，邓毅，姚雷，等.维药祖发奇尼的抗菌和解痉作用实验研究[J].时珍国医国药， 2007，18（2）：409-411.

[2]朱焱.维吾尔药神香草化学成分及平喘作用的研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学.2008.

[3]赵军，徐芳，贺金华，等.硬尖神香草化学成分研究[J].中药材，2013，36（1）：54.

[4]贾佳，许璟龙.迷迭香酸的研究现状[J].黑龙江医药，2014，27（2）：258.

[5]LETIZIA M， ELLEN H T，SILVIA D. Host Location of Hyssopus pallidus a Larval Parasitoid of the Codling Moth， Cydia Pomonella[J]. Biological Control，1999（15）：241-51.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社， 1999：78.

[7]阿提坎木·瓦合甫.维药神香草和其混淆品大苞荆芥进行了初步的质量标准研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学.2014.

[8]YUAN F， LIU R， HU M， et al. JAX2， an ethanol extract of Hyssopus cuspidatus Boriss， can prevent bronchial asthma by inhibiting MAPK/NF-κB inflammatory signaling. [J]. Phytomedicine： international journal of phytotherapy and phytopharmacology， 2019（ 57）： 305-314.

[9]BARNESARNES P J. New anti-inlammatory targets for chronic obstructive pulmonary disease[J]. Nat Rev Drug Discov， 2013， 12（7）： 543-559.

[10]CLAUDIA K， MARIELLA L， ANNA M S， et al. Romarinic acid content in basil plant grown in vitro and in hydroponics [J]. Cent Eur J Biol， 2011.

[11]正敏，廖晓光，文雪梅，等.迷迭香酸对哮喘小鼠氧化性肺损伤的保护作用[J].中国畜牧兽医，20170， 12（44）：3650-3655.

[12]ZHOU M W， JIANG R H， KIM K D， et al. Rosmarinic acid inhibits poly induced inflammatory reaction of epidermal ker-atinocytes [J]. Life Sci， 2016（155）：189-194.

[13]VENKATACHALAM K， GUNASEKARAN S， JESUDOSS V A， et al. The effect of rosmarinic acid on 1，2-dimethylhydrazine induced colon carcinogenesis [J]. Exp Toxicol Pathol， 2013，65（4）：409-418.

[14]SIVAGAMI G， VINOTHKUMAR R， et al. Modualtory efficacy of rosmarinic acid on premaligant lesions and antioxidant status in 1，2-dimethylhydrazine induced rat colon carcinogenesis [J]. Environ Toxiron Pharmacol， 2012， 32（3）：949-958.

[15]KARTHIKKUMAR V， SIVAGAMI G， VISWANATHAN P，et al. Rosmarinic acid inhibits DMH-induced cell proliferation in experimental rats[J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol，2015，26 （2）：185-200.

[16]XU Y， HAN S， LEI K， et al. Anti-Warburg effect of rosmarinic acid via miR-155 in co;orectal carcinoma cells [J]. Eur J Cancer Prev， 2016， 25（6）：481-489.

[17]BAVKHOUSE N， ROSALES L， APABLAZA C，etal. Analgesic， anti-inflammatory and antioxidant properties of Buddleja globosa，Buddlejaceae[J]. J Ethnopharmacol， 2008，116（2）：263-269.

[18]王靜，王淼.我国食品安全快速检测技术发展现状研究进展[J]. 农产品质量与安全， 2014（2）：42-47.

[19]冯雅斌，杜靓，温静.薄层色谱法在药物分析中的应用及研究进展[J]. 疾病监测与控制， 2011，5（1）：60-63.

[20]PLOKA-WASYLKA J. A new tool for the evaluation of the analytical procedure： green analytical procedure index[J]. Talanta， 2014（181）：204–209.

[21]TOBISZEWSKI M， MARC′M， GA USZKA A， et al. Greenchemistry metrics with special reference to green analytical chemistry[J]. Molecules， 2015（20）：10928–10946.

[22]GA USZKA A， MIGASZEWAKI Z M， KONIECZKA P， et al. Analytical eco-scale for assessing the greenness of analytical procedures[J]. Trends Anal Chem， 2012（37）：61-72.

（收稿日期：2021-03-05 编辑：陶希睿）