多黏类芽孢杆菌SWS-15玉米促生效果测定及其废水发酵条件优化

牛永艳 朱瑞清 毛婷 穆永松 白慧慧 王治业

摘要：多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是一类具有植物促生效果和广谱抗菌性的细菌。为筛选促生效果明显的多黏类芽孢杆菌并实现菌剂制备，从好氧污泥中分离出1株多黏类芽孢杆菌SWS-15，通过玉米苗盘试验验证其促生效果，并应用Box-Behnken 响应面优化利用粉丝厂废水发酵多黏类芽孢杆菌菌剂的条件。结果表明，菌株SWS-15发酵液中存在玉米素、赤霉素、生长素等促进植物生物的调节激素，多黏类芽孢杆菌SWS-15处理组的玉米株高和冠径相对于空白组均显著提高。响应面优化结果表明，在粉丝厂废水浓度为63.42%，初始pH值为 7.85，温度为36.05  ℃时发酵24 h，可获得SWS-15菌剂的最大活菌数6.6×109 CFU/mL。因此，多黏类芽孢杆菌SWS-15发酵菌剂不仅可以有效促进玉米苗期生长，而且使粉丝厂废水实现资源化利用，具有开发应用的前景。

关键词：多黏类芽孢杆菌;玉米;促生;废水发酵;发酵条件优化;废水利用

中图分类号： S513.06  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）22-0204-06

收稿日期：2021-07-05

基金项目：甘肃省科学院应用研究与开发项目（编号：2018JK-04）;甘肃省科学院创新团队项目（编号：2019CX004-1）。

作者简介：牛永艳（1991—），女，甘肃武威人，硕士，助理研究员，从事环境微生物修复、农牧废弃物生物处理等研究。E-mail：niuyy2014@lzu.edu.cn。

通信作者：王治业，硕士，研究员，从事微生物资源整理、整合，功能性微生物菌剂及农牧废弃物资源处理利用等研究。E-mail：zhiye_wang@sina.com。

近年来，多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）因其植物促生作用以及生物防治作用备受关注[1-2]。多黏类芽孢杆菌主要通过产生植物促进激素，促进植物根尖吸收养分，促进光合作用等机制促进植物生长，并在玉米、生菜、甜菜及菜豆等农作物上证明了其显著的促生效果[1，3]。李铭东等研究证明，30 kg/hm2的多黏类芽孢杆菌菌剂与化肥共同施用比单独施用化肥的玉米增产17.68%[4]。除此之外，多黏类芽孢杆菌在番茄[5-6]、黄瓜[7]、生菜[3]和辣椒[8-9]等作物的种植过程中还具有广谱抑菌性[6]，对细菌性、真菌性以及线虫等植物病害均有防治效果。因此，高品质、低成本的多黏类芽孢杆菌菌剂发酵工艺表现出广大的市场需求和应用前景。

甘肃省张掖市银河粉丝厂年产5 000 t粉丝、1 000 t 淀粉，同时也产生了大量含有淀粉和蛋白质的废水，造成了严重的水体污染和资源浪费。目前，对于粉丝厂的废水资源化利用主要集中在蛋白质的提取回收方面，而忽略了水资源的利用[10-11]。本研究分离鉴定出1株多黏类芽孢杆菌，验证其植物促生效果，同时以粉丝厂废水为底物进行多黏类芽孢杆菌菌剂的发酵，对发酵参数进行优化。菌剂发酵不仅以废水蛋白质为微生物生长氮源，而且将水资源用于农业灌溉，实现了粉丝厂废水的全面利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株来源为污水处理厂好氧污泥;粉丝废水由甘肃省张掖市银河粉丝厂提供。

1.2 菌株分离鉴定

取 1 g 好氧污泥于 100 mL 的无菌生理盐水中，180 r/min振荡30 min，使之充分混匀。取上清液100 μL接种到营养肉汁培养基上，在30 ℃培养1～2 d。当培养基上长出菌落时，用接种环挑取长势较好的单菌落进行划线，继续在30 ℃培养1～2 d，重复这一步骤直到得到单菌落。挑取单菌落接种到 5 mL 营养肉汁培养基摇床培养2 d，取1 mL菌液与1 mL 50%甘油混合于-80 ℃冻存，剩余菌液用BIO MPure 细菌DNA提取试剂（加拿大）提取总DNA，送北京奥科进行16S rRNA测序，将测序结果在NCBI 的 Blast 软件上进行相似性比对，并运用MEGA 5.1软件建立系统发育树[12]。

1.3 菌株发酵液植物激素测定

测定促进植物生长的玉米素（ZA） 、赤霉素（GA3） 、吲哚-3-乙酸（IAA）等植物激素的含量，以及抑制植物生长的植物激素脱落酸的含量[13-14]。菌株接种到100 mL营养肉汁培养基中，30 ℃培养48 h后，精确称取0.2 g样品，加入 2 mL预冷的 80%甲醇，匀浆，保鲜膜密封后于 4 ℃冷浸过夜，4 ℃ 5 000 r/min 离心 10 min，取上清液，残渣继续用 80%甲醇萃取，振荡，超声 2 次合并上清液，4 ℃氮吹至水相。加入 2 mL石油醚脱色 3 次，水相用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，4 ℃氮吹至干，加入pH值为3.5的乙酸溶液，过 C18 小柱净化，用甲醇洗脱，收集洗脱液 4 ℃减压至干燥，用流动相溶解定容、过 0.22 μL 滤膜，待测。检测仪器为高效液相色谱仪（HPLC）;测试色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm;5 μL） 进样量为10 μL;波长为254 nm;流速为1.0 mL/min;流动相为甲醇 ∶乙酸水溶液（pH值为3.6）=20 ∶80 （体积比）。

1.4 菌株对玉米种子发芽指数影响的测定

菌株SWS-15发酵48 h后，取10 mL发酵液，置于250 mL锥形瓶中，用去离子水稀释10倍、50倍、100倍3个浓度梯度，搖匀，静置 0.5 h 后，取上清液于预先安装好滤纸的过滤装置上过滤，收集过滤后的浸提液备用。试验以蒸馏水为参比溶液。在9 cm培养皿中垫上2张滤纸，均匀放入10粒大小基本一致、饱满的玉米种子，加入浸提液5 mL，盖上皿盖，在25 ℃培养箱中避光培养48 h，统计发芽率和测量根长[12-13]。试验以报道中具有玉米促生效果的解淀粉芽孢杆菌[14]发酵液为参照，以空白培养基为对照组（CK-培养基）。

种子发芽指数（GI）计算公式：GI=A1×B1A2×B2×100%。

式中：A1表示菌株SWS-15发酵液培养种子的发芽率，%;B1表示菌株SWS-15發酵液培养种子的平均根长，mm;A2表示蒸馏水培养种子的发芽率，%;B2表示蒸馏水培养种子的平均根长，mm。

1.5 玉米苗盘试验

将多黏类芽孢杆菌按1%接种于营养肉汁培养基中，30 ℃培养48 h后用无菌水调节菌悬液浓度为1×108 CFU/mL（D600 nm约为0.5），放4 ℃冰箱备用。采用灌根方式进行接种，接种量为10 mL/株。将采集的土壤干燥过筛，随后将处理好的土壤分成2份，A组不做处理，B组加入6%生物炭和10%有机肥混匀，分别装入72孔的育苗盘中。苗盘试验共根据施肥不同分为6组处理，分别为A-CK1：土+水 5 mL;A-CK2：土+培养基5 mL;A-T：土+SWS-15菌液5 mL;B-CK1：土+6% 生物炭+10%有机肥+水5 mL;B-CK2：土+6% 生物炭+10%有机肥+培养基5 mL;B-T：土+6% 生物炭+10%有机肥+SWS-15菌液5 mL）。每个处理均有3个平行，每个平行中种18株玉米，玉米品种为金岭67。玉米苗盘试验于2020年5月1—30日在甘肃省张掖市民乐县进行。5月1日种植，整个试验期间所有苗盘无差别对待，并始终保持土壤湿润，6 d后（2020年5月7日）统计出苗率，29 d后（2020年5月30）用卷尺测量株高和冠径。

1.6 粉丝厂废水理化参数测定

废水的重铬酸盐指数（CODCr）按照HJ 828—2017《水质 化学需氧量的测定 重铬酸盐法》用重铬酸钾法测定;总磷按照GB 11893—1989《水质 总磷的测定 钼酸氨分光光度法》检测;总氮按照HJ 636—2012《水质 总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》检测;废水中钾按照HJ 776—2015《水质 32种元素的测定 电感耦合等离子体发射光谱法》检测，pH值用pH计直接测量。

1.7 单因素试验

试验设计主要考察废水浓度、初始pH值以及温度对粉丝厂废水发酵多黏类芽孢杆菌的影响。取新鲜的粉丝厂废水按体积比梯度稀释（100%、80%、60%、40%、20%）后调节pH值为7.0，100 mL装入250 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min，按1%接种多黏类芽孢杆菌，30 ℃培养24 h后测定活菌数，从而确定利于多黏类芽孢杆菌生长的废水浓度。初始pH值梯度设定为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将100 mL 50%的废水按试验设计调节pH值后装入250 mL的锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min，按1%接种多黏类芽孢杆菌，30 ℃培养24 h后测定活菌数。多黏类芽孢杆菌按1%接种到100 mL，121 ℃灭菌20 min 后的50%的废水中，分别按发酵温度梯度（24、28、32、36、40 ℃）培养24 h后测定活菌数。

1.8 菌株Box-Behnken 响应面优化

依据单因素试验结果，将废水浓度、初始pH值以及温度设为X，将多黏类芽孢杆菌活菌数设为Y，利用Design-Expert软件中Box-Behnken 模型进行响应面优化试验，各因素的水平如表1所示。

1.9 数据分析

利用软件SPSS 17.0进行数据显著性分析，利用OriginPro 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 菌株SWS-15的鉴定

从污水处理厂污泥中纯化获了15株细菌，通过 16S rRNA基因比对后，鉴定得到1株类芽孢杆菌属细菌（SWS-15），与Paenibacillus polymyxa strain YC0573  16S rRNA 基因序列相似度高达 96%（图1）。MEGA 5.1 软件系统发育分析结果显示，该菌株的遗传进化与多黏类芽孢杆菌最近。菌株 SWS-15 在营养肉汁培养基上前期形成规则的半透明圆形菌落，后期菌落顶部逐渐凸起变白，挑起有黏性。

2.2 多黏类芽孢杆菌SWS-15对玉米的促生效果

2.2.1 多黏类芽孢杆菌SWS-15发酵液植物调节激素检测结果

应用HPLC方法测定菌株SWS-15发酵液，菌株SWS-15的发酵液中玉米素（ZA），赤霉素（GA3）、吲哚-3-乙酸（IAA）均被检出，未检出脱落酸（ABA），证明菌株SWS-15不仅能产生ZA和GA3，而且可以产生IAA，但没有检测出抑制生长的植物激素脱落酸。具体的定量结果如表2所示，菌株SWS-15产赤霉素的量相对于ZA、IAA较高。

2.2.2 多黏类芽孢杆菌SWS-15对玉米发芽指数的影响

由表3可知，SWS-15菌株发酵液在3个稀释梯度下玉米主根发芽指数较对照组和解淀粉芽孢杆菌发酵液高。其中，稀释100倍后的SWS-15菌株发酵液玉米主根发芽指数为283.1%，比解淀粉芽孢杆菌的主根发芽指数188.6%高出94.5%，比对照组高出117.2%。在同等条件下，SWS-15菌株发酵液玉米主根加侧根发芽指数为369.6%，比解淀粉芽孢杆菌的199.4%高出170.2%，比对照组高出219.7%。因此，可以看出SWS-15菌株对玉米种子发芽指数影响明显。同时，随着稀释倍数的增加，发芽指数具有增加的趋势，这一结果为多黏类芽孢杆菌菌剂的使用剂量提供了参考。

2.2.3 多黏类芽孢杆菌SWS-15对玉米出苗率、苗高及冠径的影响

由图2-A可知，A-CK1组出苗率为79.6%，A-T组出苗率为100%，多黏类芽孢杆菌对玉米出苗率影响显著。B-CK1和B-T组出苗率均为100%，没有差异。由图2-B和图 2-C 可知，与不施菌液的CK1、CK2相比，SWS-15菌液处理后的玉米株高和冠径均显著提高。在土壤中加入生物炭和有机肥后玉米的长势反而没有不加的处理组好，A-T组玉米的苗高和冠径均显著高于B-T组，说明肥料对玉米的苗期生长阶段影响甚微。

2.3 粉丝厂废水理化特性及废水浓度、pH值、温度对菌体生长的影响

银河粉丝厂在利用豌豆生产淀粉的过程中产生大量的废水，取豆水池上清液检测其基本理化特性。由表4可知，废水呈酸性，平均pH 值为4.63，CODCr高达13 847 mg/L， 同时， 还含有丰富的氮磷钾。废水浓度、初始 pH值及温度对菌株SWS-15生长的影响如图 3 所示。由图3-A可知，在培养24 h后，菌株SWS-15的活菌数随着废水浓度的增加先上升后降低，废水浓度高于 60%时，菌株SWS-

15的活菌数达到最大值为6.28×109 CFU/mL。由图3-B可知，pH值为8.0时，菌株SWS-15的长势最好，活菌数达到6.33×109 CFU/mL。由图3-C可知，培养菌株SWS-15的最适温度为36 ℃。

2.4 废水发酵最优条件的响应面结果

依据单因素试验结果，以多黏类芽孢杆菌SWS-15活菌数为Y，以废水浓度（A）、初始pH值（B）及温度（C）为考察因素，将所得试验数据采用  Design-Expert  V8.0.6  软件进行多元回归拟合的二次多向回归方程为Y=6.52+0.23A-0.29B+0.21C-0.15AB-0.050AC-0.03BC-0.67A2-1.05B2-0.30C2。由表5可知，模型P值<0.01，表明响应面回归模型达到了极显著水平。失拟项F值为5.119，P值为0.074 3，P值>0.05，失拟项不显著，模型的确定系数R2=0.985 2。由回归模型和方差分析结果可知，方程一次项和二次项对SWS-15菌株活菌数的影响达到极显著水平;交互项AB、AC、BC对活菌数的影响不显著。失拟项P>0.05，说明模型与试验数据之间拟合度好，可用此模型预测多黏芽孢杆菌的生长情况。根据F值大小可以判断出各个因素对活菌数的影响主次顺序为初始 pH值>废水浓度>温度。

图4直观地解释各个变量和变量之间对多黏芽孢杆菌活菌数的影响。根据 Design-Expert 软件对建立的回归方程进行参数优化分析，可以得出在废水浓度、初始pH值及温度在理论上分别取63.42%、7.85、36.05 ℃时，可得理论上的最大活菌数6.60×109 CFU/mL。

3 讨论与结论

本研究分离鉴定出1株多黏类芽孢杆菌SWS-15，菌落有黏稠性，与报道[18]相符，16S rRNA 基因序列与Paenibacillus polymyxa strain YC0573 同源性达96%，初步鉴定该菌属于类芽孢菌属（Paenibacillus）。HPLC检测结果表明，菌株SWS-15发酵液中检测出玉米素、赤霉素以及生长素等促进植物生产的激素。目前报道中发现，多黏类芽孢杆菌菌株 CF05能产生IAA[19]，但能同时产生多种植物促生激素的多黏类芽孢杆菌鲜有报道。玉米种子发芽指数结果表明，多黏类芽孢杆菌SWS-15发酵液对玉米发芽指数影响明显。同时，玉米苗盘试验结果证明，多黏类芽孢杆菌SWS-15处理的玉米长势比对照组好，多黏类芽孢杆菌处理的玉米苗高和冠徑均显著提高。多黏类芽孢杆菌菌剂可在玉米种植时作为基肥使用，可提高苗期玉米长势。响应面优化结果表明，利用粉丝厂废水发酵多黏类芽孢杆菌SWS-15菌剂的最佳条件：废水浓度为63.42%，初始pH值为7.85，温度为36.05 ℃。在该条件下发酵24 h，可获得最大的活菌数6.60×109 CFU/mL。

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