肉鸽圆环病毒、腺病毒及疱疹病毒Ⅰ型混合感染的多重PCR检测

陈俊红 何宇 祁宇晨 刘裕鹏 邢光东 王莹 徐善金 方光远 戴鼎震

摘要：运用多重PCR同时检测肉鸽病原（圆环病毒、腺病毒及皰疹病毒Ⅰ型）的方法，分别设计与合成3种病毒基因扩增引物，并提取疑似病鸽的肝脏样品DNA、进行单一PCR扩增及基因序列测定，结果分别获得了大小为239、418、618 bp的DNA产物。通过摸索多重PCR反应条件，应用多重PCR同时检测3种病毒基因片段，同时获得了鸽疱疹病毒Ⅰ型、鸽圆环病毒及鸽源腺病毒的基因片段。再对疑似混合感染这3种病毒的肝脏样品进行检测，发现50%（6/12）样品存在3种病毒的混合感染、25%（3/12）样品存在鸽圆环病毒和鸽源腺病毒的混合感染、8.3%（1/12）样品存在鸽源腺病毒和Ⅰ型鸽疱疹病毒的混合感染、8.3%（1/12）样品存在鸽圆环病毒和Ⅰ型鸽疱疹病毒的混合感染、8.3%（1/12）样品未发生任何感染。结果表明，多重PCR可快速检测鸽疱疹病毒Ⅰ型、鸽圆环病毒及鸽源腺病毒的混合感染，表明运用三重PCR检测3种病毒混合感染有很好的应用价值。

关键词：鸽圆环病毒;鸽源腺病毒;鸽疱疹病毒Ⅰ型;多重PCR;基因测序

中图分类号：S858.39   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）22-0167-04

收稿日期：2021-05-08

基金项目：江苏省“六大人才高峰”D类项目;金陵科技学院“创客虚拟班”立项项目（编号：2017008）。

作者简介：陈俊红（1990—），女，安徽宿州人，博士，讲师，主要从事预防兽医、比较医学及中兽医学研究。E-mail：chenjunhong@jit.edu.cn。

通信作者：戴鼎震（1964—），男，江苏兴化人，博士，教授，主要从事预防兽医、中兽药及中西兽医结合研究。E-mail：dzdai@163.com。

鸽圆环病毒（PiCV）、鸽源腺病毒（PiAdV）及鸽疱疹病毒Ⅰ型（PiHV-1）是近年来在鸽子体内发现的病毒性病原体。PiCV是一种单股DNA病毒，体型很小、球形、无囊膜，常经口传染1岁以下鸽子[1-2]。该病毒也可经蛋垂直传播，并可造成鸽的免疫抑制[3]。目前，尚无任何合适疫苗控制鸽圆环病毒感染。PiAdV引起鸽呕吐及水样下痢，传播迅速，任何年龄的鸽皆可感染。短时间鸽舍内所有鸽均可感染，如继发大肠杆菌等病原感染，则死亡率很高[4-6]。PiHV-1感染成年鸽感染后多呈潜伏感染[7]，但可向环境排毒。及时注射疫苗也仍不足以阻止感染鸽带毒。因此，及时检测并隔离阳性鸽群非常重要。PiAdV、PiHV-1及PiCV通常以混合感染的形式出现，这大大增加了死亡率，给鸽业带来严重危害。由此可见，这3种病原的快速准确检测非常重要。PCR是一种快速而实用的检测方法，准确、灵敏、方便。目前，国内外多见于运用单一PCR进行检测[8-10]，也有针对2种病原的PCR[11-12]，但缺点是检测成本高、工作量大。如能运用三重PCR同时检测这3种病原目的基因，就可快速甄别混合感染鸽，及时淘汰病鸽，净化种群。运用多重PCR对PiAdV、PiHV-1及PiCV混合感染的检测并不多见，本研究拟分别设计与合成3种病毒基因扩增引物，构建多重PCR反应体系，同时检测3种病毒，为快速检疫病原提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试验时间：2019年3月5日至2020年5月20日;地点：金陵科学院兽医微生物实验室。

1.1.1 病料 来自镇江句容、南京六合区及浦口鸽场的疑似病鸽;PiCV、PiHV-1及PiAdV的对照阳性样品均为笔者所在单位鉴定保存。

1.1.2 试剂 DNA提取试剂盒及胶回收试剂盒（广州基迪奥生物科技有限公司）、DNA marker（康为世纪 CW0636），分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 模板基因分别是：PiAdV的六邻体蛋白（Hexon）基因来自GenBank中MF576429.1;PiHV-1的多聚酶 polymerase 基因序列来自KJ995972.1）;PiCV Rep蛋白和衣壳蛋白（cap）基因序列来自JX901125.1。利用Primer 5.0软件设计从保守区筛选3对特异性引物，预计扩增的目的基因大小见表1。引物合成来自南京思普金公司。

1.2.2 DNA的提取 根据试剂盒提取要求进行DNA提取。取疑似病鸽口腔、鼻窦、肝脏膜样品 10～20 mg，研磨，加缓冲液混合混匀，55 ℃水浴，使组织充分酶解。再加消化液，混匀，于70 ℃水浴维持10 min。然后过柱纯化，得到DNA，保存于 -20 ℃ 备用。

1.2.3 单一PCR检测 采用设计的引物分别用提取的3种病毒模板进行单一PCR检测，PCR扩增反应。由表2可知，预混液为2×Es Taq MasterMix。每对引物浓度均为10 mmol/L。反应条件：98 ℃预变性5 min;95 ℃ 10 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸5 min，16 ℃ 维持5 min。扩增产物经凝胶电泳，观察产物大小。

1.2.4 多重PCR检测 利用上述引物针对PiCV、PiAdV及PiHV-1 模板建立三重PCR扩增体系。由表3可知，反应条件：98 ℃预变性5 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环; 72 ℃延伸5 min，16 ℃ 维持5 min。扩增完成后，2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.5 PCR产物基因序列测定 按试剂盒程序将产物进行回收、送检、测序。

1.2.6 临床样品多重PCR检测 采集镇江、六合及浦口等地鸽场采集场疑似病料，共18份，提纯DNA模板，进行三重PCR扩增，统计结果。

2 结果与分析

2.1 单一PCR产物的电泳结果与分析

从3种病毒标准DNA模板扩增出来的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳。由图1可知，PCR产物扩增结果分别为大小在600～800、400～500、200～300 bp 的单一清晰条带。表明针对标准阳性模板的引物设计是准确的，与预期欲获得的616、418、 239 bp 基因片段大小相符。

2.2 多重PCR产物的电泳结果与分析

由图2可知，通过多重PCR获得了PiAdV、PiCV及PiHV-1的特异性基因片段，经2%琼脂糖

凝胶电泳，与标准DNA对照相比发现，3条条带分别位于600～800、400～500、200～300 bp间，大小均分别与单一PCR所扩增片段大小相对应，表明3对特异性引物混合在一起进行扩增，未出现相互互补现象，它们均扩增出了清晰的DNA条带，符合预期扩增616、418、239 bp基因片段大小。

2.3 DNA序列测定结果与分析

对3对引物扩增到的DNA产物进行了核酸序列测定，分别为PiAdV，616 bp;PiCV，418 bp;PiHV-1，239 bp。结果证实各自扩增的DNA片段大小的正确性。经过DNA序列比对及编码蛋白的阅读框架分析，发现所扩增的目的基因片段核酸序列分别与各自的标准模板基因序列相同，且阅读框架与所编码的Hexon蛋白、DNA polymerase及PiCV的Rep与cap蛋白相同，证明所扩增的目的基因正确。

2.4 临床样品多重PCR结果与分析

由表4可知，经三重PCR检测，在总共18份检测样品中，PiAdV、PiHV-1及PiAdV检测呈阳性的分别是5、12、8份，结果与单一PCR相比完全相符合。

由图3可知，泳道2、5、6、8、9、11均从样品中扩增到3种病毒基因片段，表明存在这3种病毒混合感染，感染率达50%（6/12）;泳道3、4、7见有2个扩增条带，大小分别对应于PiAdV及PiCV目的片段大小，反映出样品存在这2种病毒混合感染，感染率25%（3/12）;泳道10也有2个条带，大小分别对应PiAdV及PiHV-1目的基因片段，说明发生了这2种病原双重感染，感染率为8.3%（1/12）;泳道13存在2个条带，分别对应PiHV-1、PiCV目的片段，说明存在这2种病原感染，占样品数8.3%（1/12）。泳道12无条带，判定样品无感染。结果表明，三重PCR能一次性检出单一感染、双重感染及三重感染。

3 讨论与小结

PiAdV、PiCV及PiHV-1混合感染不仅仅是单纯的3种传染病，且均参与导致了更严重的幼鸽疾病综合征（YPDS）[3-4，13]，往往引起很高死亡率。因此，同时快速检测病鸽这3种病毒的感染对于预防控制鸽病具有重要意义。目前，能够用来检测这3种病毒的方法有病毒分离与鉴定、单一PCR检测和病理组织学检测[14]。但分离鉴定法费时、费力、诊断周期长。病毒可存在于病鸽的口腔、鼻窦、肝脏、食管等部位，病毒分离费时、费力，且分离较为困难，分离率不高，这对于快速诊断、隔离病鸽是不利的。相对来说，PiHV-1分离容易一些，而PiAdV及PiCV的分离培养较为困难。如赵盼盼在野鸽体内分离到了野鸽PiHV，并进行了分析[15]。Hess等通过肝细胞培养出了PiAdV[5]。尚未见PiCV分离的报道，这就限制了对其开展进一步研究。由于这3种病毒均可产生包涵体，因此，可以通过病理切片观察包涵体。腺病毒感染鸽的肝细胞、小肠绒毛的上皮细胞中可检查到核内包涵体[5]。Gough等报道了在鸽的法氏囊内发现了圆环病毒样粒子[1]，但这些检测方法均需逐个检测，不适合大量同时检测。

相比之下，运用PCR检测就较为快速、准确，加之3种病毒均为DNA类病毒，PCR扩增不需要进行反转录，因而更为方便。如Zhang等[7]、余旭平等[9]及薛媚等[10]通过PCR分别检测到了PiHV-1及PiCV的基因。蒋文明等运用双重PCR同时检测到了PiAdV及PiHV-1的基因，总体上体现出PCR快速、准确的特点，但仍不能一次性同时检测3种病原[11]。

本研究首先使用单一PCR方法检测PiAdV、PiHV-1及PiCV，通过变性、退火、延伸3个基本反应步骤，进行循环，准确地获得了PiAdV、PiHV-1及PiCV特异性片段，经电泳获得了大小不同的条带。结果表明，此法具有特异性强、灵敏度高、快捷等优点。在此基础上通过重构反应体系，将3种反应体系合而为一，并优化反应条件，同时成功擴增到到了DNA产物，并通过基因序列测定确认是这3种病毒基因，从而证实多重PCR一次性检测混合感染不仅快速、灵敏，而且特异性强、成本低。从多重PCR扩增的产物看，DNA条带清晰可变，大小适中，便于观察。经过临床样品的进一步扩大检测，还能够观察到检测鸽样品发生感染的实际状况（即有的鸽子3种病原同时感染，有的仅感染其中2种）。结果还提示，由于病毒分布全身多个组织器官，为增大扩增成功率，可在多个部位进行取样，但肝脏样品必须采集。总之，本试验三重PCR可同时检测3种病毒，敏感、准确、快速，且省时省力，适用于检测种鸽病原混合感染。不过试验方法还值得进一步优化，如最低浓度试验、最优反应条件等。此外，还可开展更多病原的基因多重检测，或者重新设计合成引物进行PCR扩增，以便扩增到病毒不同的亚型基因，从而更精细地进行病原检测。

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