体外法研究亚麻籽油对瘤胃甲烷、氢气产量和脂肪酸组成的影响

2021-12-08张秀敏马志远谭支良

动物营养学报 2021年11期

谭健王荣张秀敏马志远王敏* 谭支良

(1.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125；2.内蒙古农业大学动物科学技术学院，呼和浩特 010018)

畜牧业温室气体排放被认为是农业活动领域最主要的排放源之一[1]。目前，研究人员已经证实甲烷是引发地球表面温室效应不断增加的主要原因[2]。在畜牧业甲烷排放中，97%的甲烷来自于反刍家畜[3]。除此之外，反刍动物甲烷排放是导致饲料能量损失的重要因素，占饲粮摄入总能的2%～12%[4]。因此，如何减少反刍动物胃肠道甲烷排放已经成为当前研究的热点科学问题。反刍家畜87%～89%的甲烷是在瘤胃内产生[5]，并且瘤胃内80%以上的甲烷是由甲烷菌利用氢和二氧化碳合成[6]。有研究结果表明，在饲粮中添加可以利用氢的添加剂，可以改变瘤胃内氢的流向，减少氢被甲烷菌的利用，进而降低甲烷排放[7-8]。

亚麻籽油是一种富含不饱和脂肪酸的优质性植物油脂，目前已经广泛应用于各种反刍家畜的研究[9-13]。亚麻籽油进入瘤胃后发挥作用的机制主要分为2个方面：一方面，在瘤胃微生物的作用下发生生物氢化反应，最终生成硬脂酸[14]。在这个过程中，亚麻籽油会作为氢池与甲烷菌竞争氢的利用。另一方面，亚麻籽油中的不饱和脂肪酸会通过与细菌矿物质反应形成皂化物，改变细菌细胞膜的生物流动性，从而对微生物产生毒害作用[15]。这2种不同的作用机制会对瘤胃内氢代谢和甲烷生成产生不同的影响，因此，本研究旨在从瘤胃内氢代谢相关的代谢产物着手，揭示不同剂量的亚麻籽油抑制瘤胃甲烷生成的作用机制，研究结果可以为提高反刍家畜能量利用效率和减少甲烷排放提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 发酵底物

本试验取500 g左右的青贮玉米样品，在65 ℃条件下烘干，粉碎并过1 mm筛，然后存放在密封袋中备用。发酵底物中添加的亚麻籽油购买于张家口市某食用油有限责任公司，产品符合GB/T 8325—2008标准一级要求，含有肉豆蔻酸0.01%、棕榈酸5.93%、棕榈油酸0.05%、十五烷酸0.05%、硬脂酸3.54%、顺式油酸17.70%、亚油酸17.60%、亚麻酸54.70%、花生酸0.28%、花生烯酸0.14%。为了能够确保亚麻籽油与发酵底物混合均匀，通过乳化和酶解技术，将亚麻籽油与膨化玉米等重量均匀混合。本试验设置6种添加剂量[0(对照)、1%、2%、3%、4%和5%，干物质基础]，以亚麻籽油替代膨化玉米，确保最终每个发酵瓶中发酵底物、亚麻籽油和膨化玉米粉重量一致，如表1所示。

表1 发酵底物组成Table 1 Composition of fermentation substrate g

1.2 体外发酵试验

以3只安装永久性瘤胃瘘管的湘东黑山羊为瘤胃液供体动物，试验山羊饲喂精料和稻草混合的饲粮，饲粮精粗比为40∶60，自由饮水。晨饲前通过瘤胃瘘管采集新鲜瘤胃液，迅速装入提前充满二氧化碳的保温瓶并带回实验室，经过6层脱脂纱布进行过滤，随后将过滤后的瘤胃液置于39.5 ℃恒温水浴锅且不断通入纯二氧化碳保持厌氧状态。称取0.6 g发酵底物至135 mL厌氧发酵瓶中，然后在39.5 ℃条件下，加入12 mL瘤胃液和48 mL人工瘤胃缓冲液[16]。根据Wang等[17]的流程，利用全自动化体外培养系统开展体外发酵试验。发酵瓶通过导管与三通电磁阀和压力传感器连接。压力传感器与计算机连接，能够实时监测记录发酵瓶中的压力，并通过压力与气体体积间关系计算气体生成量[18]。当厌氧瓶中压力超过9 kPa，电磁阀打开，厌氧瓶中顶部空间的气体释放并进入气相色谱仪(安捷伦7890A，安捷伦公司，美国)，从而对气体中的氢气和甲烷产量进行测定。氢气和甲烷产量根据Wang等[19]的公式进行计算。每个发酵瓶为1个平行，每次试验的每个处理设置3个平行，重复体外发酵试验3次，每次试验使用来自2只不同瘘管羊的混合瘤胃液。

1.3 样品采集与测定

体外发酵试验48 h后终止，立即测定pH(Starter300；奥豪斯仪器有限公司，上海)。然后取2 mL的样品在4 ℃下，12 000 r/min离心10 min，将1.5 mL的上清转移到2 mL离心管中，添加0.15 mL 25%(m/v)的偏磷酸酸化，并置于-20 ℃保存过夜。样品解冻后，4 ℃，12 000 r/min，再次离心10 min，利用气相色谱7890 A对样品中的挥发性脂肪酸组分进行分析[20]。然后取1 mL样品，参考Zhang等[21]的方法对样品中长链脂肪酸比例进行测定。最后参考Zhang等[22]的方法，计算发酵底物干物质降解率以及每克可降解底物发酵的产气量、甲烷和氢气产量。

1.4 数据统计

根据Wang等[19-20]提出的模型，结合非线性软件对体外模拟瘤胃发酵产气曲线进行拟合，并计算起始底物降解速率(FRD，×10-2/h)。利用SPSS 21.0软件的一般线性模型程序对数据进行方差分析和Duncan氏多重比较，使用正交多项式比较分析各个指标随亚麻籽油添加剂量的变化。P<0.05时为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同添加剂量亚麻籽油对体外瘤胃发酵产气参数的影响

由表2可知，与对照组相比，添加亚麻籽油(≥2%)显著降低干物质降解率(P<0.05)，其中2%、3%、4%和5%亚麻籽油组的干物质降解率分别降低了3.43%、5.31%、8.02%和5.70%；添加亚麻籽油(≥4%)显著降低每克底物的产气量和潜在最大产气量(P<0.05)，但对每克降解底物的产气量、产气速率和起始底物降解速率无显著影响(P>0.05)。其中，4%和5%亚麻籽油组每克底物的产气量分别降低了7.92%和12.4%，潜在最大产气量分别降低了6.15%和11.00%。另外，随着亚麻籽油添加剂量的增加，干物质降解率、每克底物的产气量、潜在最大产气量和产气速率均呈现线性下降的变化趋势。

表2 不同添加剂量亚麻籽油对体外瘤胃发酵产气参数的影响Table 2 Effects of different supplemental levels of linseed oil on parameters of gas production in in vitro rumen fermentation

2.2 不同添加剂量亚麻籽油对体外瘤胃发酵甲烷和氢气产量的影响

由表3可知，与对照组相比，添加亚麻籽油(≥2%)显著降低每克底物的甲烷产量、每克降解底物的甲烷产量和甲烷浓度(P<0.05)。其中2%、3%、4%和5%亚麻籽油组的每克底物的甲烷产量分别降低了12.50%、13.50%、17.40%和23.60%，每克降解底物的甲烷产量分别降低了9.43%、8.62%、10.20%和18.90%，甲烷浓度分别降低了9.31%、8.79%、13.30%和18.60%。随着亚麻籽油添加剂量的增加，每克底物的甲烷产量、每克降解底物的甲烷产量和甲烷浓度均呈现线性下降。与对照组相比，5%的亚麻籽油显著降低每克底物的氢气产量、每克可降解底物的氢气产量和氢气浓度(P<0.05)，分别降低了50.10%、47.00%和52.60%。随着亚麻籽油添加剂量的增加，每克底物的氢气产量、每克降解底物的氢气产量和氢气浓度均呈现线性下降。

表3 不同添加剂量亚麻籽油对体外瘤胃发酵甲烷和氢气产量的影响Table 3 Effects of different supplemental levels of linseed oil on methane and hydrogen production in in vitro rumen fermentation

2.3 不同添加剂量亚麻籽油对体外瘤胃发酵挥发性脂肪酸生成和长链脂肪酸组成的影响

由表4可知，与对照组相比，随着亚麻籽油添加剂量的增加，丙酸摩尔比例显著升高(P<0.05)，总挥发性脂肪酸浓度、乙酸摩尔比例和乙丙比显著下降(P<0.05)。

表4 不同添加剂量亚麻籽油对体外瘤胃发酵挥发性脂肪酸生成的影响Table 4 Effects of different supplemental levels of linseed oil on volatile fatty acid production in in vitro rumen fermentation

由表5可知，与对照组相比，亚麻籽油(≥4%)显著降低肉豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸和总的不饱和脂肪酸摩尔比例(P<0.05)，显著增加顺式油酸、亚麻酸和总不饱和脂肪酸摩尔比例(P<0.05)。

表5 不同添加剂量亚麻籽油对体外瘤胃发酵中长链脂肪酸组成的影响Table 5 Effects of different supplemental levels of linseed oil on long chain fatty acid profile in in vitro rumen fermentation %

3 讨论

在体外条件下，产气量可以作为反映饲粮可发酵程度的重要指标，通常产气量越高，表明饲粮的可消化程度越高，也越有助于反刍家畜对饲粮的利用[23]。在本研究结果中，亚麻籽油(≥4%)显著降低每克底物的产气量和潜在最大产气量。这可能是因为亚麻籽油中的亚油酸和亚麻酸具有抑菌功能，可以抑制瘤胃微生物活性[24]。有研究结果表明，亚麻籽油可以降低奶牛瘤胃内纤维素分解菌的丰度[13]，降低瘤胃内纤维素降解酶的活性[10]。Maia等[15]发现，亚麻酸不仅对纤维降解微生物区系有毒性作用，而且对体外培养的纤维素降解真菌(Neocallimastixfrontalis)也具有抑制作用。这也与本研究结果中干物质降解率随着亚麻籽油添加剂量的增加而线性降低相一致。另外，亚麻籽油对每克降解底物的产气量没有显著影响，这说明亚麻籽油主要是通过对瘤胃微生物的毒性作用抑制饲料饲草的降解、消化和利用，使产气量减少。

据报道，亚麻籽油可以降低奶牛甲烷产量的40.4%～64.3%[25-26]。Martin等[27]研究结果表明，在体内条件下，亚麻籽油的添加剂量每增加1%，甲烷产量降低4.1%～4.8%。Szumacher-Strabel等[28]发现，在体外条件下，每添加1%亚麻籽油，甲烷产量降低10.1%。在本研究结果中，添加亚麻籽油组的甲烷产量降低了12.50%～23.60%。这些研究结果表明，亚麻籽油在体外抑制甲烷生成的效果明显高于体内，这可能是因为体内瘤胃流通速率会明显降低亚麻籽油在瘤胃中的滞留时间，进而减少亚麻籽油的瘤胃生物氢化效率。另外，体外抑制甲烷生成效果之间的差异可能与亚麻籽油的来源和发酵底物不一样所引起。

亚麻籽油主要含有十八碳不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸通过顺-反异构化反应生成反式脂肪酸中间体，最后双键加氢生成饱和脂肪酸[14]。在这个过程中，不饱和脂肪酸可以作为电子受体与甲烷菌竞争氢，从而减少甲烷生成。有研究结果表明，亚麻籽油在利用氢气还原油酸生成硬脂酸的过程中所需要的自由能为-66 J/mol[29]，而甲烷菌利用氢气和二氧化碳合成甲烷所需要的自由能为-16.9 J/mol[30]。与甲烷合成相比，亚麻籽油中不饱和脂肪酸生物氢化过程所需要的氢分压更低。这说明亚麻籽油中的不饱和脂肪酸可以吸收瘤胃内氢而成为新的氢池。这提示添加亚麻籽油会通过减少瘤胃内氢气产量，进而降低甲烷产量。前期研究结果表明，瘤胃内氢主要被甲烷菌用于甲烷合成[6]，当甲烷生成受到抑制后，氢气产量往往会显著升高[23]，然而，在本研究结果中，亚麻籽油抑制甲烷生成的情况下，每克底物的氢气产量、每克降解底物的氢气产量和氢气浓度显著降低，这说明大部分氢气被亚麻籽油中的不饱和脂肪酸利用。然而，在Judy等[31]的研究结果中发现，增加奶牛饲粮中亚麻酸浓度，并没有影响甲烷产量。这可能是因为不饱和脂肪酸生物氢化作用对甲烷的抑制作用较小，说明亚麻籽油除了作为电子受体减少甲烷生成，还有其他作用机制抑制甲烷生成。

有研究结果表明，饱和脂肪酸以及氢化处理后的植物油脂同样会抑制甲烷产生[32-33]，因此亚麻籽油对甲烷的抑制作用可能是不饱和脂肪酸生物氢化与饱和脂肪酸对抑制甲烷菌共同作用导致的结果。在Martin等[25]试验中，添加亚麻籽油后，饲粮中的粗脂肪含量从2.6%增加到8.4%。同样，Martin等[26]试验中，添加亚麻籽油后，粗脂肪含量从2.3%增加到7.6%。而在Judy等[31]的研究中，2组饲粮之间粗脂肪含量没有显著差异(4.50% vs 4.87%)，这也可能是仅仅提高饲粮脂肪酸含量而不改变粗脂肪含量对甲烷排放没有显著影响的重要原因。有研究结果表明，亚麻籽油对原虫具有毒性作用[34]，而几乎所有的瘤胃纤毛原虫表面都附着有甲烷菌[34]，当原虫受到抑制后，甲烷菌也可能会受到抑制。另外，在Sato等[35]研究结果中，亚麻籽油会降低瘤胃产甲烷菌中占主导地位的甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)，从而使甲烷产量降低。

在本研究结果中，随着亚麻籽油剂量的增加，总挥发性脂肪酸浓度、乙丙比和乙酸摩尔比例呈线性降低，而丙酸摩尔比例呈线性升高的变化趋势。其中，总挥发性脂肪酸浓度的变化可能是与亚麻籽油抑制底物降解有关。Sato等[35]发现，亚麻籽油会促进丙烯酸和琥珀酸途径代谢产生丙酸。这可能是导致瘤胃乙丙比降低和丙酸摩尔比例升高的重要原因。有研究结果表明，亚麻籽油中不饱和脂肪酸在瘤胃内会有60%～98%被生物氢化[36]。在本试验中，亚麻籽油含有90%以上的十八碳不饱和脂肪酸，体外发酵结束后，发酵液中的脂肪酸主要以饱和脂肪酸为主(>85%),这说明大部分不饱和脂肪酸通过生物氢化作用，转变成了饱和脂肪酸。但是，在本研究结果中，硬脂酸摩尔比例却没有显著变化，这可能是因为本试验测定的是长链脂肪酸摩尔比例而不是浓度。顺式油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸摩尔比例的升高可能是与亚麻籽油中不饱和脂肪酸生物氢化不完全相关。