补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马运动性能、糖代谢及抗氧化能力的影响

2021-12-08张文杰李晓斌欧阳文杨开伦

动物营养学报 2021年11期

张文杰李晓斌刘律马艳鲁豪杨昊欧阳文杨开伦*

(1.新疆农业大学动物科学学院，新疆肉乳用草食动物营养重点实验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆伊犁哈萨克自治州昭苏种马场，昭苏 835000)

马匹在进行高强度的训练或比赛时，往往伴随着肌肉损伤、运动疲劳和恢复缓慢等生理问题。因此，在保证科学训练基础上为专项运动马补充特殊营养添加剂，对专项运动马的能源补充和疲劳恢复具有重要意义。胍基乙酸(GAA)是哺乳动物体内肌酸(Cr)及其磷酸化衍生物磷酸肌酸的唯一前体物质[1]，GAA主要在肾脏由L-精氨酸和甘氨酸内源合成，通过血液循环运输到肝脏，在胍基乙酸-N-甲基转移酶的催化下再经甲基化生成Cr[2]。外源性补充Cr已被证实对杂交马[3]、伊犁马[4]和纯血马[5]运动潜力的提升有显著的作用。然而，外源性补充Cr时存在不稳定和成本高等缺点，导致生物学效价不能充分的发挥，而GAA具有性质稳定、生物利用度高和成本低等特点，可能是比Cr更适合的运动补充剂。在动物合成Cr的过程中，需要甲基供体，外源性补充GAA更会引起甲基供体需求的增加[6]。此外，外源性补充GAA会导致同型半胱氨酸含量的升高[7]，对动物的健康有潜在的威胁，而使用甲基供体的营养添加剂来抑制GAA生成的同型半胱氨酸是十分有效的[8]。外源性补充GAA和甲基供体的联合使用或能发挥更大的优势。

甜菜碱(Bet)是甘氨酸的三甲基衍生物，能为机体提供可用性较高的甲基[9]；GAA合成Cr的过程中需要S-腺苷蛋氨酸作甲基供体，而S-腺苷蛋氨酸来源于蛋氨酸(Met)，适宜补充Bet或Met可使GAA更有效地转化为Cr。补充GAA及GAA和甲基供体对耐力的提高和肌肉力量的增强主要集中在人的相关研究[10-11]中，而在运动马研究中却鲜有报道。因此，本试验选取伊犁马为试验动物，在饲粮中补喂GAA、GAA+Bet以及GAA+Met，探究补喂GAA和不同甲基供体物对伊犁马运动性能、糖代谢及抗氧化能力的影响，丰富伊犁马生理代谢学理论，为促进伊犁马高水平运动训练和竞赛能力的发挥提供科学理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

试验于2020年9月16日至2020年10月11日在新疆维吾尔族自治区伊犁哈萨克自治州昭苏种马场进行。

1.2 试验设计及分组

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

续表1项目Items含量Content磷P0.39消化能DE/(MJ/kg)8.91

GAA补喂量参考Setoue等[12]的研究结果，Bet和Met的补喂量按照GAA转化为Cr消耗的甲基数来确定(Bet有3个甲基，其中2个可供代谢循环利用，GAA转化为Cr消耗1个甲基，那么Bet的添加剂量为GAA的1/2，补喂量为30 mg/kg BW；Met有1个甲基可供利用，GAA转化为Cr消耗1个甲基，那么Met的补喂量与GAA之比为1∶1，由于DL-Met的利用率为50%，则Met的补喂量为152 mg/kg BW)。试验设计及分组见表2。将各组的GAA、Bet、Met、玉米和次粉制作成颗粒后等分为2份，与精料补充料充分混合后每天08:00和20:00补喂，进行为期25 d的试验。

表2 试验设计及分组Table 2 Experimental design and groups

1.3 饲养管理

所有试验马匹均单厩饲养在同一环境中，每天每匹马饲喂8 kg干牧草和4 kg精料补充料，自由饮水。饲喂时，马匹预先采食1 kg干牧草，再补给精料补充料，待精料补充料采食完毕后，继续添加干牧草。每天按时打扫马厩，清除粪便，更换垫草，及时驱虫。

1.4 训练方案及场地

试验马匹每天进行1次速度训练，马匹训练时间安排在11:00—13:00或者17:30—19:30。首先进行热身训练，骑手骑乘试验马先在草道上慢步10 min，随即进入沙道，进行10 min快步训练，然后15 min慢跳训练，最后停止训练，牵遛5～10 min，直至马匹呼吸平稳。训练场地为新疆昭苏种马场伊犁马测试调训中心，赛道由椭圆形沙道和草道组成。内部沙道由细沙构成，深度40 cm，底部为土基，道宽21 m，周长为800 m；外部草道由天然的牧草形成，宽20 m，周长为1 000 m。

1.5 指标测定

1.5.1 比赛成绩测定

补喂试验开始前(第0天)和试验结束后(第25天)在新疆昭苏种马场伊犁马测试调训中心进行2 000 m速度赛，赛道周长为1 000 m，用秒表记录每匹马的比赛用时，用以下公式计算每秒速度值、平均耗时减少以及成绩提高幅度。

每秒速度值(m/s)=2 000(m)/比赛用时(s)；平均耗时减少(s)=试验第0天比赛用时(s)-试验第25天比赛用时(s)；成绩提高幅度(%)=[平均耗时减少(s)/试验第0天比赛用时(s)]×100。

1.5.2 心率、呼吸频率测定

试验第25天进行2 000 m速度赛，在赛前2 h、赛后即刻和赛后2 h用Polar脉搏仪(购自上海益联科教设备有限公司)测定每匹马的心率，同时通过观察胸廓起伏次数记录每匹马的呼吸频率。

1.5.3 血浆生化指标的测定

于试验第25天进行2 000 m速度赛，分别在赛前2 h、赛后即刻和赛后2 h采集血样，通过马匹颈静脉采集血液4 mL至氟化钠抗凝管，3 500 r/min离心15 min，制备血浆，分装至1.5 mL Eppendorf管中，标记后-20 ℃冷冻保存。

马匹血浆中GAA、Cr、肌酐(Crn)含量在新疆农业大学动物科学学院动物营养与饲料科学实验室采用高效液相色谱法测定[13]；血浆过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、肌酸激酶(CK)活性，总抗氧化能力(T-AOC)，丙二醛(MDA)、葡萄糖(GLU)、乳酸(LD)含量送至北京华英生物技术研究所采用比色法测定；血浆胰岛素(INS)、胰高血糖素(Gc)含量送至北京华英生物技术研究所采用酶联免疫吸附法测定。

1.6 统计分析

数据采用Excel 2010进行初步整理，试验结果以平均值(mean)和均值标准误(SEM)表示。所有试验数据采用SPSS 19.0统计软件的one-way ANOVA进行单因素方差分析，差异显著则用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05作为差异显著的判断标准，0.05

2 结果与分析

2.1 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马2 000 m比赛成绩的影响

由表3可知，各组第0天比赛用时、第25天比赛用时和每秒速度值间均无显著性差异(P>0.05)。GAA组、GAA+Bet组和GAA+Met组在平均耗时减少方面显著高于对照组(P<0.05)；GAA组在成绩提高幅度方面显著高于GAA+Met组、对照组(P<0.05)，高于GAA+Bet组，但无显著性差异(P>0.05)。

表3 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马2 000 m比赛成绩的影响Table 3 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on results of 2 000 m race in Yili horses (n=5)

2.2 补喂胍基乙酸和不同甲基供体对伊犁马2 000 m比赛心率和呼吸频率的影响

由表4可知，赛前2 h，各组马匹心率和呼吸频率稳定；赛后即刻，各组马匹心率和呼吸频率均升高；赛后2 h，各组马匹心率和呼吸频率恢复至正常水平。各组马匹心率和呼吸频率在赛前2 h、赛后即刻和赛后2 h均无显著性差异(P>0.05)。

表4 补喂胍基乙酸和不同甲基供体对伊犁马2 000 m比赛心率和呼吸频率的影响Table 4 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on heart rate and respiratory rate of 2 000 m race in Yili horses (n=5)

2.3 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆GAA、Cr及Crn含量的影响

由表5可知，赛前2 h、赛后即刻和赛后2 h，各组马匹血浆GAA、Cr和Crn含量虽均无显著性差异(P>0.05)，但各试验组血浆GAA、Cr和Crn含量在对照组基础上有一定的提高。

表5 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆GAA、Cr及Crn含量的影响Table 5 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on plasma GAA,Cr and Crn contents in Yili horses (n=5) μmol/L

2.4 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆肌酸激酶活性、乳酸含量的影响

由表6可知，GAA组、GAA+Bet组、GAA+Met组血浆肌酸激酶活性在赛前2 h均有增加的趋势(P=0.094)，乳酸含量也有小幅度升高；各组间血浆肌酸激酶活性和乳酸含量在赛后即刻和赛后2 h均无显著性差异(P>0.05)。

表6 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆肌酸激酶活性、乳酸含量的影响Table 6 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on plasma creatine kinase activity and lactic acid content in Yili horses (n=5)

续表6项目Items对照组ControlgroupGAA组GAAgroupGAA+Bet组GAA+BetgroupGAA+Met组GAA+MetgroupSEMP值P-value乳酸LD/(mmol/L)赛前2hPre-race2h0.820.920.880.900.050.154赛后即刻Immediatelyatpost-race1.121.131.111.440.910.385赛后2hPost-race2h0.740.780.730.650.040.739

2.5 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆糖代谢的影响

由表7可知，各组间血浆葡萄糖含量在赛前2 h、赛后即刻和赛后2 h均无显著性差异(P>0.05)，GAA组和GAA+Bet组血浆胰岛素含量在赛后即刻、赛后2 h显著高于对照组(P<0.05)，GAA组血浆胰高血糖素含量在比赛前后均显著高于对照组(P<0.05)，GAA+Bet组在赛前2 h和赛后即刻较对照组有显著升高(P<0.05)，GAA组总体优于GAA+Bet组。

表7 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆糖代谢的影响Table 7 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on plasma glucose metabolism in Yili horses (n=5)

2.6 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆抗氧化指标的影响

由表8可知，赛前2 h，GAA组、GAA+Bet组和GAA+Met组血浆CAT、GSH-Px、SOD活性及T-AOC均高于对照组，MDA含量均低于对照组。其中，GAA组血浆GSH-Px、SOD活性和T-AOC显著高于对照组(P<0.05)，GAA+Bet组和GAA+Met组血浆SOD活性显著高于对照组(P<0.05)；赛后即刻，GAA组、GAA+Bet组和GAA+Met组血浆CAT活性显著高于对照组(P<0.05)，GAA+Bet组血浆MDA含量显著低于对照组(P<0.05)；赛后2 h，GAA组血浆T-AOC显著高于对照组(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。

表8 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆抗氧化指标的影响Table 8 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on plasma antioxidant indices in Yili horses (n=5)

续表8项目Items对照组ControlgroupGAA组GAAgroupGAA+Bet组GAA+BetgroupGAA+Met组GAA+MetgroupSEMP值P-value谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/(U/mL)赛前2hPre-race2h379.15b487.75a428.19ab398.40b15.550.047赛后即刻Immediatelyatpost-race312.13384.37359.62339.0311.050.113赛后2hPost-race2h276.07328.31299.89291.0912.580.549超氧化物歧化酶SOD/(U/mL)赛前2hPre-race2h73.04c110.43a90.85b85.90b3.43<0.001赛后即刻Immediatelyatpost-race70.5676.4782.1272.484.400.826赛后2hPost-race2h49.1254.8148.6447.871.810.544总抗氧化力T-AOC/(U/mL)赛前2hPre-race2h6.27b7.43a7.01ab6.71ab0.150.023赛后即刻Immediatelyatpost-race7.117.196.846.510.150.405赛后2hPost-race2h6.30ab7.03a6.05ab5.08b0.240.019丙二醛MDA/(nmol/mL)赛前2hPre-race2h3.302.712.472.940.120.064赛后即刻Immediatelyatpost-race3.17a2.68ab2.40b2.87ab0.100.035赛后2hPost-race2h4.30a3.22b3.90ab4.40a0.170.042

3 讨论

3.1 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马运动性能的影响

补充GAA或Cr具有增强肌肉力量[10]、改善运动表现[14]、缓解运动疲劳[15]、促进肌肉生长和提高抗氧化力[4]等作用。本试验中，试验组2 000 m比赛用时较对照组而言均有缩短，特别是在平均耗时减少和成绩提高幅度方面，GAA组和GAA+Bet组显著高于对照组，说明补喂GAA和GAA+Bet均能改善伊犁马运动速度，其原因可能是由于补喂GAA或GAA和Bet后，增加了储存在骨骼肌中磷酸肌酸和ATP的含量，并在剧烈运动期间发挥着重要的作用[16]。Teixeira等[3]研究指出，为平均体重为429 kg的杂交马口服补充0.28 g/kg BW Cr 45 d后，对其比赛成绩、心率和脉压无显著性影响。李晓斌等[4]发现，给伊犁马补喂38 g Cr后，可提高伊犁马1 000 m的运动成绩，对赛前1 h、赛后即刻和赛后30 min的心率无显著影响。结果均与本试验相似。

3.2 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆GAA、Cr及Crn含量的影响

GAA是Cr生物合成的唯一前体物质，是能量代谢的重要底物。GAA可以在酶催化反应下由L-Arg和甘氨酸内源性形成，也可从富含动物蛋白质的食物中摄取[17]。GAA转运到肝脏后甲基化为Cr，Cr作为高能载体在细胞中发挥重要作用[18]。本试验中，给伊犁马补喂GAA和不同甲基供体物(Bet、Met)后发现，GAA组、GAA+Bet组和GAA+Met组血浆GAA和Cr含量在赛前2 h、赛后即刻和赛后2 h均高于对照组，说明补喂的GAA经肠道吸收后，通过血液循环进入肝脏和肾脏，在肝脏、肾脏中GAA甲基化生成Cr，随后又从肝脏释放到血液循环中，经肌酸转运蛋白将Cr转入肌纤维和其他组织[19]。外源性补充GAA可增加GAA和Cr的生物利用度。Sewell等[5]证实，补喂0.05 g/kg BW的Cr后，可增加纯血马血浆中Cr含量。Ostojic等[10]以48名健康志愿者为研究对象，通过口服补充1.2、2.4和4.8 g/d GAA 6周后发现，志愿者血浆GAA、Cr含量均有显著性升高，且存在剂量效应。与本试验略有不同，可能是由于物种之间的吸收机制存在差异，马是草食动物，与人类相比，肌酸的吸收可能会延迟或减少。GAA合成Cr的过程中需要S-腺苷蛋氨酸作甲基供体，而S-腺苷蛋氨酸来源于Met。本试验前期未对基础饲粮中Met进行测定，仅考虑在原有饲粮基础上给伊犁马补喂GAA时，可能会造成机体甲基的不足，因此，额外补充了甲基供体物(Bet和Met)，然而，GAA+Bet组和GAA+Met组与GAA组结果相近，并未达到显著提高GAA和Cr含量的效果。在试验后期对基础饲粮中Met含量测定后发现，精料补充料Met含量为0.63%，青干草Met含量为0.23%，每匹马每天采食4 kg精料补充料(Met摄入量为25.2 g)和8 kg青干草(Met摄入量为18.4 g)，试验组马匹平均体重为418.40 kg，外源性补喂GAA量为25.10 g，说明在本试验研究条件下，基础饲粮中的Met能满足外源性补喂GAA时所需要的甲基，不需要再额外补充。GAA组、GAA+Bet组和GAA+Met组血浆Crn含量在赛前、即刻和赛后均略高于对照组，与GAA、Cr含量的结果相符。Crn是Cr和磷酸肌酸的代谢产物，Crn含量的小幅度增加与Cr的含量升高有关。该试验结果与Stead等[20]和Ostojic等[21]给人补充GAA和不同甲基供体物的研究结果一致。

3.3 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆肌酸激酶活性、乳酸含量的影响

肌酸激酶是催化磷酸肌酸向ADP转移的最具特征性的肌肉组织酶之一，马匹在训练或比赛期间，肌酸激酶活性的高低常作为肌肉细胞损伤的检测指标[22]。Franciscato等[23]证实，肌酸激酶活性的升高表明肌肉损伤，肌酸激酶活性的下降速度反映肌肉恢复的快慢程度。在本试验中，GAA组和GAA+Met组血浆肌酸激酶活性在赛后即刻和赛后2 h较对照组均有所降低，说明在给伊犁马饲粮中补喂GAA或GAA和Met联合组后，可在一定程度上降低伊犁马机体肌酸激酶的活性，进而对其肌肉的快速恢复有积极的作用。而在赛前2 h，3个试验组血浆肌酸激酶活性在对照组基础上均有升高，说明马匹在运动前，补充GAA和不同甲基供体物(Bet、Met)后，可小幅度提高伊犁马血浆肌酸激酶的活性。试验结果可能与机体Cr含量的升高有关。Dickinson等[24]认为，肌酸激酶活性的增加可通过外源性补充Cr来实现。也有学者认为，血清肌酸激酶活性的小幅增加与运动期间脂质过氧化和肌肉组织缺氧导致的异常细胞膜通透性有关[25]。

马匹在进行短途、高强度的运动时会产生大量乳酸，造成肌肉酸痛、乏力等疲劳症状，影响骨骼肌收缩能力和马匹的运动性能[26]。在本试验中，赛前2 h，对照组血浆乳酸含量略低于试验组，可能是因为试验组马匹在完成2 000 m比赛时，由于比赛用时的缩短，导致试验组马匹的运动强度高于对照组，进而增加了丙酮酸和乳酸等代谢产物的含量[27]。此外，GAA+Bet组在赛后即刻和GAA+Met组在赛后2 h，血浆乳酸含量有小幅度的降低，说明补喂GAA+Bet和GAA+Met对伊犁马赛后机体乳酸清除有一定的作用。

3.4 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆糖代谢的影响

马匹在进行时高强度运动时，会引起血糖和骨骼肌中的肌糖原加速分解。Eijnde等[28]和Ju等[29]研究发现，补充Cr可改善人和大鼠葡萄糖的代谢，增加肌糖原的积累。在本试验中，给伊犁马补喂Cr前体物质GAA和GAA+Bet、Met联合组后发现，试验组血浆葡萄糖含量在赛后即刻高于对照组，说明给伊犁马补喂GAA或GAA+Bet、Met后，增加了伊犁马血浆的葡萄糖含量，试验结果可能与马匹体内Cr含量的增加有关。此外，本试验的3个试验组在比赛即刻和比赛后血浆胰岛素和胰高血糖素含量均出现增加。导致这一现象的原因可能是马匹在高强度运动时，血糖被大量消耗，胰高血糖素分泌增多，糖异生作用随之增强[30]。其次，由于补喂GAA或GAA+Bet后，马匹机体中血浆氨基酸含量增加，氨基酸生糖引发了胰岛素和胰高血糖素含量发生了变化[6]。另外，Van Loon等[31]发现，补充Cr和碳水化合物会显著提高胰岛素含量，刺激胰岛素的分泌和增加葡萄糖的受体。Rooney等[32]和李晓斌等[4]也证实，长期补充Cr会提高大鼠和马的血浆胰岛素和葡萄糖的含量。因此，本试验胰岛素和胰高血糖素含量的升高也可能与Cr含量的增加有关。

3.5 补喂胍基乙酸和不同甲基供体物对伊犁马血浆抗氧化能力的影响

运动会造成大量的活性氧(ROS)和自由基的积累[33]。在马匹运动训练中，如何快速清除机体产生的自由基，增加CAT、SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性和降低脂质过氧化反应中MDA含量来缓解氧化应激，对运动能力的提高有着重要的意义。在本试验中，GAA组、GAA+Bet组和GAA+Met组均能提高赛前2 h和赛后即刻血浆中CAT、GSH-Px、SOD活性，说明补喂GAA、GAA+Bet和GAA+Met均可使伊犁马血浆抗氧化能力增强。试验结果可能与GAA和不同甲基供体物进入伊犁马机体后，被迅速代谢为Cr有关，而Cr已被证实可作为外源性抗氧化剂来提高伊犁马和焉耆马的抗氧化能力[4,34]。此外，GAA组在马匹血浆抗氧化能力提高方面，优于GAA+Bet组和GAA+Met组，说明本试验条件下，基础饲粮中的Met可为马匹机体提供足够的甲基，不需要额外补充甲基供体物便可使抗氧化能力显著提高。本试验结果与Wang等[35]给生长育肥猪补喂不同水平GAA的结果相一致。因此，GAA也可作为一种良好的抗氧化剂来清除马匹体内的ROS和自由基，提高其运动能力。