徐长卿丹皮酚通过调控Wnt/β-catenin通路保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤

吴成武 王伟 汤休书 张凯

(黔西南州中医院骨伤科，贵州 兴义 562400)

骨关节炎是一种以关节软骨损伤为主要病变的慢性关节疾病，多发生于中老年人群，严重危害患者健康。目前，临床常采用非甾体抗炎药治疗骨关节炎，但其有较多副作用，如引起胃肠消化道出血、心血管疾病等〔1,2〕。研究显示，天然植物化学物因有安全、高效、副作用较小等优点在骨关节炎的治疗中有潜在的应用前景〔3〕。徐长卿丹皮酚是中药徐长卿的主要活性成分之一，与非甾体抗炎药有相似的药理作用，有镇痛、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等功效〔4〕。研究显示，徐长卿丹皮酚可抑制骨关节炎软骨细胞凋亡〔5〕，缓解痛风性关节炎〔6〕。目前，还未有徐长卿丹皮酚影响骨关节炎软骨细胞作用机制的相关报道。研究显示，Wnt/β-catenin信号通路在调节软骨细胞、维持软骨基质健康等方面起重要作用，与骨关节炎的发病机制存在密切联系〔7〕。本研究通过白细胞介素(IL)-1β诱导体外分离培养的大鼠软骨细胞，探讨徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞损伤的影响及其是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。

1 材料与方法

1.1细胞和实验试剂 雄性SD大鼠：8周龄，质量160～220 g，健康清洁级购自北京维通利华公司，合格证号SCXK(京)2018-0006；胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒购自北京索莱宝公司；酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、酶切caspase-9、Wnt和β-catenin抗体均购自美国Cell Signaling公司；基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-9和MMP-13抗体均购自福州迈新生物技术有限公司；性别决定区Y框蛋白(SOX)-9和二型胶原蛋白(Col-Ⅱ)抗体均购自美国Santa Cruz公司；干扰素(IFN)-γ、IL-6和IL-8试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验方法

1.2.1软骨细胞分离和培养 参照文献方法分离培养大鼠软骨细胞〔8〕。SD大鼠脱颈椎处死，碘伏乙醇消毒，暴露膝关节，用刀刮取表面软骨，手术剪剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，采用酶消化法分离培养软骨细胞。原代软骨细胞分离后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基、置于37℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。细胞培养7 d后，进行换液处理，此后每2～3 d更换1次培养基。细胞融合至80%左右时，0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。

1.2.2细胞分组处理 软骨细胞分为对照(NC)组：正常培养24 h；IL-1β组：10 μg/L〔8〕的IL-1β作用软骨细胞24 h；低剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组：10 μg/L的IL-1β与60 μg/ml徐长卿丹皮酚共同作用24 h；中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组：10 μg/L的IL-1β与120 μg/ml徐长卿丹皮酚共同作用24 h；高剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组：10 μg/L的IL-1β与180 μg/ml徐长卿丹皮酚共同作用24 h；徐长卿丹皮酚+IL-1β+Wnt/β-catenin信号通路激活剂(LiCl)组：20 μmol/L〔9〕LiCl作用24 h后，10 μg/L的IL-1β与120 μg/ml徐长卿丹皮酚共同作用24 h。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 取第4代对数生长期的软骨细胞，以每孔1×104个接种于24孔细胞培养板中。细胞贴壁后，按照上述分组处理。培养结束后，收集细胞培养上清液，-20℃保存备用。胰酶消化细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明，分别取各组1.0×106个细胞，加入400 μl结合缓冲液，细胞混悬后，加入10 μl Annexin V-FITC，混匀，室温避光孵育15 min。然后再加入5 μl PI，室温避光孵育5 min。最后再加入100 μl结合缓冲液，混匀后上流式细胞仪检测。

1.2.4Western印迹法检测蛋白表达 细胞分组和处理同1.2.3。培养结束后，收集细胞，加入RIPA蛋白裂解液提取细胞中总蛋白。使用BCA对蛋白定量后，取适量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白变性后，以每孔30 μg蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，湿转至硝酸纤维素膜，置于5%脱脂牛奶中进行封闭，时间1 h。加入一抗，4℃孵育过夜。再加入辣根过氧化酶标记的二抗IgG，室温孵育1 h。加入ELC显影液，避光显影。

1.2.5酶联免疫吸附试验检测IFN-γ、IL-6和IL-8水平 取1.2.3中保存的各组细胞培养上清液，3 500 r/min离心10 mim，分别参照IFN-γ、IL-6和IL-8试剂盒操作说明，检测细胞培养上清液中IFN-γ、IL-6和IL-8水平。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的影响 与NC组比较，IL-1β组软骨细胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均显著升高(均P<0.05)。与IL-1β组比较，低、中、高剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组软骨细胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均显著降低(均P<0.05)。与低剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组比较，中、高剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组软骨细胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均显著降低(P<0.05)；而中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组和高剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1、图2。

图1 流式细胞术检测软骨细胞凋亡

2.2徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞炎症因子分泌的影响 与NC组比较，IL-1β组软骨细胞IFN-γ、IL-6和IL-8水平均显著升高(均P<0.05)。与IL-1β组比较，低、中、高剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组软骨细胞IFN-γ、IL-6和IL-8水平均显著降低(均P<0.05)。与低剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组比较，中、高剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组IFN-γ、IL-6、IL-8水平均显著降低(P<0.05)；中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组和高剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞IFN-γ、IL-6、IL-8及凋亡的影响

2.3中剂量徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞MMP和Col-Ⅱ表达的影响 与NC组比较，IL-1β组软骨细胞SOX-9和Col-Ⅱ表达均显著降低(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表达均显著升高(均P<0.05)。与IL-1β组比较，中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组软骨细胞SOX-9和Col-Ⅱ表达均显著升高(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表达均显著降低(均P<0.05)。见图3和表2。

1～5:NL组，IL-1β组,低剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组,中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组,高剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组图2 Western印迹检测软骨细胞酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白的表达

1～3：NC组、IL-1β组、中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组；图4同图3 Western印迹检测软骨细胞SOX-9、Col-Ⅱ、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达

表2 中剂量徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞Wnt-β-catenin信号通路、MMP和Col-Ⅱ表达的影响

2.4中剂量徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞Wnt-β-catenin信号通路的影响 与NC组比较，IL-1β组软骨细胞Wnt1和β-catenin蛋白表达均显著升高(均P<0.05)。与IL-1β组比较，中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组软骨细胞Wnt1和β-catenin蛋白表达均显著降低(均P<0.05)。见表2和图4。

图4 Western印迹检测软骨细胞Wnt1和β-catenin表达

2.5Wnt-β-catenin信号通路激活剂对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和炎症因子分泌的影响 与中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组比较，徐长卿丹皮酚+IL-1β+LiCl组软骨细胞凋亡率、酶切caspase-3和酶切caspase-9蛋白水平均显著升高(均P<0.05)，IFN-γ、IL-6和IL-8炎性因子表达均显著升高(均P<0.05)。见图5和表3。

表3 Wnt-β-catenin信号通路激活剂和徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡、凋亡蛋白和炎症因子分泌的影响

图5 Western印迹检测软骨细胞酶切caspase-3蛋白和酶切caspase-9蛋白的表达

2.6Wnt-β-catenin信号通路激活剂和徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞MMP和ColⅡ表达的影响 与中剂量徐长卿丹皮酚+IL-1β组比较，徐长卿丹皮酚+IL-1β+LiCl组软骨细胞SOX-9和Col-Ⅱ表达均显著降低(均P<0.05)，MMP-3、MMP-9和MMP-13表达均显著升高(均P<0.05)。见表4和图6。

表4 Wnt-β-catenin信号通路激活剂和徐长卿丹皮酚对IL-1β诱导的软骨细胞MMP和ColⅡ表达的影响

1,2：徐长卿丹皮酚+IL-1β组，徐长卿丹皮酚+IL-1β+Licl组图6 Western印迹检测软骨细胞SOX-9、Col-Ⅱ、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达

3 讨 论

随着年龄的增长，骨关节炎的发病率呈上升趋势，对中老年人的生命健康造成极大威胁〔10〕。研究发现，骨关节炎涉及到软骨、滑膜释放炎症介质等过程，可导致MMP表达增多，最终引起软骨细胞凋亡〔11〕。软骨细胞是关节软骨中唯一的一种细胞，在调节胞外基质合成和降解、维持软骨基质稳态等方面发挥重要作用〔12〕。IL-1β是一种致炎性细胞因子，可引起软骨细胞退变，加速骨关节炎的病理进程〔13〕。研究显示，徐长卿丹皮酚有抑制软骨细胞凋亡及MMP-1表达的作用〔14〕，可治疗骨关节炎，但其作用机制目前还未明确。

软骨细胞外基质的丢失和异常重塑是骨关节炎的中心病理机制〔15〕。正常关节软骨中，软骨细胞的凋亡和增殖处于动态平衡。骨关节炎病变过程中，软骨细胞凋亡增加，细胞外基质降解，进而引起关节软骨的退行性病变〔16〕。caspase家族在细胞凋亡中发挥重要作用。caspase-9是caspase级联反应的启动因子，而caspase-3是细胞凋亡执行者，其活化后，细胞凋亡进入不可逆转阶段〔17〕。本研究说明IL-1β可加剧软骨细胞凋亡，徐长卿丹皮酚可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，延缓关节软骨退变过程。

骨关节炎是一种慢性炎症疾病，IL、IFN等炎性因子参与骨关节炎的发病过程，抑制软骨细胞的炎症反应有助于控制或减轻骨关节炎进展。正常关节中IFN-γ表达量极少，关节滑液和血清中IFN-γ表达越多，说明炎症反应越严重〔18〕。IL-1β可促进IL-6等炎性因子的产生。陈亮等〔19〕研究显示，骨关节炎患者血清中炎性因子IFN-γ、IL-6表达增加，可作为骨关节炎临床诊断和治疗的生物学指标。本研究结果表明IL-1β可增加软骨细胞炎症反应，徐长卿丹皮酚可能通过降低软骨细胞炎症因子的表达保护其免受损害。

骨关节炎软骨细胞的显著特征是既表达Col-Ⅱ和蛋白聚糖，又表达细胞肥大分化标记物如MMPs〔20〕。Col-Ⅱ是关节软骨基质胶原的主要结构成分，约占胶原总量的90%。SOX-9是促进软骨形成因子，参与骨骼系统发育，可增加软骨细胞Col-Ⅱ的合成〔21〕。MMPs参与骨关节软骨和基质的转换过程。MMP-3在骨关节炎早期可降解Ⅸ型胶原，与骨关节炎早期胶原网络水肿有关。MMP-9属于明胶酶，可降解Col-Ⅱ。MMP-13是所有MMPs中最有效的Col-Ⅱ降解酶〔22〕。抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13等表达可有效抑制骨关节炎软骨的降解，为骨关节炎的治疗提供了新方向。本研究结果表明徐长卿丹皮酚可通过调控SOX-9、Col-Ⅱ及MMP的表达抑制软骨降解。

Wnt/β-catenin信号通路是一条依赖Wnt细胞外信号和β-catenin核内信号发挥作用的信号通路，与软骨基质代谢、关节软骨去分化及软骨细胞凋亡密切相关。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键调控因子，其表达过高可促进软骨细胞凋亡，导致关节软骨退变〔23〕。本研究结果表明Wnt/β-catenin信号通路信号通路被激活，徐长卿丹皮酚可抑制软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活，徐长卿丹皮酚通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低IL-1β诱导的软骨细胞凋亡、炎性因子及相关MMP的表达，并促进SOX-9和Col-Ⅱ蛋白表达，从而保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤。

综上，徐长卿丹皮酚可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤，在骨关节炎治疗中有一定的应用前景。