石蒜碱下调RACK1抑制口腔鳞癌细胞增殖、凋亡

梁源 邵建民 杨旭 杨文超 万兵

(1漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462002；2漯河市中心医院)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)起病隐匿、恶性程度高，具有生存率低、病死率高等特点〔1〕。目前，伴随生活条件的改善、寿命的增长及环境污染等因素的改变，OSCC的发病率和死亡率呈现明显的上升趋势，发病年龄亦趋向年轻化〔2〕。目前该病主要采用手术、放疗、化疗及中医等疗法，虽已取得较大进展，但治疗后的复发率和转移率依然较高〔3〕。因此，寻找低毒性、高选择性的抗OSCC药物，是目前急需解决的课题。石蒜碱为一种异喹啉类生物碱，主要从石蒜鳞茎分离纯化出来，具有良好的抗病毒、抗炎、抗肿瘤活性〔4〕。然而石蒜碱对OSCC的影响鲜有报道。活化的蛋白激酶C1受体(RACK1)为一种支架蛋白，其在多种肿瘤中均有表达，并呈现明显的高表达。研究〔5〕发现，RACK1低表达显著抑制OSCC细胞的增殖，促进细胞凋亡。但目前关于RACK1与石蒜碱诱导的OSCC细胞增殖、凋亡调控关系还不太明确。因此，本研究针对石蒜碱抗OSCC作用与RACK1的关系进行了研究，为OSCC研究提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 人OSCC CAL-27细胞株购自上海慧颖生物科技有限公司。石蒜碱购自南京景竹生物科技有限公司，高效液相色谱(HPLC)≥98%，含0.1%DMSO的DMEM配置成不同浓度；兔抗人Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl)-2、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、RACK1抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗购自美国，Sigma公司；RACK1 Human siRNA购自Origene公司，美国。倒置荧光显微镜购自Nikon Corp；酶标仪购自美国，BioTek。

1.2方法

1.2.1细胞培养 CAL-27细胞株接种到含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养，胰蛋白酶消化传代。

1.2.2细胞活力检测 取对数期密度为1×104个/ml CAL-27细胞株接种于96孔板，100 μl/孔，24 h贴壁后弃上清。加入含有石蒜碱的DMEM 100 μl，石蒜碱终浓度分别为0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 μmol/L，对照组只加等量的培养基。每孔重复3次。分别培养24 h、48 h、72 h，每孔加入CCK-8 10 μl，培养2 h，于450 nm测定光密度值(A)，计算细胞活力。抑制率(%)=1-(A给药-A空白)/(A对照-A空白)×100。实验重复3次。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率 5.00、2.50、1.25 μmol/L石蒜碱作用于对数期CAL-27细胞株48 h后，胰酶消化，1 200 r/min，离心半径17.39 cm，离心5 min，收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻重悬细胞并计数。 取5万重悬的细胞，1 200 r/min，离心半径17.39 cm，离心5 min，弃上清，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加5 μl Annexin V-FITC，10 μl PI，混匀，培养15 min，立即进行流式细胞仪分析。

1.2.4Western印迹 总蛋白常规提取，二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白浓度。20 μl蛋白样品加样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，并转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%山羊血清封闭1 h，加入一抗(Ki67、 PCNA、Bcl-2、Bax、RACK1和β-actin的稀释比例分别为1∶2 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶2 000、1∶2 000和1∶1 000)，4℃孵育过夜，HRP标记的二抗孵育2 h，凝胶成像系统成像，并进行灰度分析。

1.2.5敲低RACK1的表达对CAL-27细胞株增殖的影响 细胞分组：对照组、石蒜碱组、石蒜碱+RACK1 siRNA组。其中石蒜碱干预浓度为2.50 μmol/L，依据分组计划，RACK1 siRNA转染24 h后，加入石蒜碱继续培养，48 h后，采用CCK-8法检测细胞活力，方法同1.2.2。

1.2.6敲低RACKl的表达对CAL-27细胞株凋亡的影响 参照1.2.5分组，流式细胞仪检测细胞凋亡率，方法同1.2.3。 Western印迹检测Bcl-2、Bax水平，方法同1.2.4。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析、LSD-t法。

2 结 果

2.1石蒜碱对CAL-27细胞增殖的影响 CCK-8实验结果表明，CAL-27细胞抑制率组间比较，差异有统计学意义(F组间=7.408，P<0.05)；同时抑制率随着时间延长，呈增长趋势，差异有统计学意义(F时间=91.276，P<0.05)；并且处理因素与时间有交互作用(F交互=9.438，P<0.05)。其中48 h时石蒜碱对CAL-27细胞IC50为7.635 μmol/L。而0.1%的DMSO 48 h时的抑制率为(4.73±0.05)%。见表1。同时，石蒜碱处理48 h后，与对照组比较，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜碱能显著降低增殖蛋白Ki67、PCNA水平(P<0.05)。见图1，表2。

表1 石蒜碱对CAL-27细胞增殖的影响

1～4：对照组、石蒜碱1.25 μmol/L组、石蒜碱2.50 μmol/L组、石蒜碱5.00 μmol/L组；图3、4同图1 石蒜碱对增殖标记蛋白的影响

表2 石蒜碱对增殖标记蛋白的影响

2.2石蒜碱对CAL-27细胞凋亡的影响 对照组细胞凋亡率为(3.5±0.4)%，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜碱处理后凋亡率分别为(12.4±1.2)%、(20.4±1.3)%、(30.6±1.4)%。与对照组比较，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜碱处理后细胞凋亡率增加明显(P<0.05)。见图2。同时，与对照组比较，不同浓度的石蒜碱能明显提高CAL-27细胞Bax的蛋白水平，降低Bcl-2的蛋白水平，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3、图3。

图2 石蒜碱对CAL-27细胞凋亡的影响

表3 石蒜碱对凋亡蛋白的影响

图3 Western印迹检测凋亡蛋白的表达

2.3石蒜碱对RACK1蛋白的影响 对照组RACK1表达水平为(0.85±0.03)，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜碱处理后RACK1表达水平分别为(0.64±0.05)、(0.21±0.03)、(0.12±0.02)。与对照组比较，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L石蒜碱处理后RACK1表达水平均明显下降(均P<0.05)。见图4。

图4 Western印迹检测RACK1蛋白的表达

2.4敲低RACKl的表达对CAL-27细胞株增殖的影响 与对照组比较，石蒜碱组和石蒜碱+RACK1 siRNA组增殖率明显增加(P<0.05)；与石蒜碱组比较，石蒜碱+RACK1 siRNA组增殖率明显增加(P<0.05)。见表4。

2.5敲低RACKl的表达对CAL-27细胞株凋亡的影响 与对照组比较，石蒜碱组和石蒜碱+RACK1 siRNA组凋亡率明显增加(P<0.05)；与石蒜碱组比较，石蒜碱+RACK1 siRNA组凋亡率明显增加(P<0.05)。见图5。与对照组比较，石蒜碱组和石蒜碱+RACK1 siRNA组明显提高CAL-27细胞Bax蛋白水平，降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05)；与石蒜碱组比较，石蒜碱+RACK1 siRNA组Bax蛋白水平明显增加，Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.05)。见表4、图6。

表4 敲低RACKl对石蒜碱调控增殖、凋亡的影响

图5 流式细胞仪检测细胞凋亡

1～3：对照组、石蒜碱组、石蒜碱+RACK1 siRNA组图6 敲低RACK1的表达对CAL-27细胞株凋亡蛋白的影响

3 讨 论

石蒜碱为来源于石蒜鳞茎的异喹啉类生物碱，药理研究〔6〕显示，石蒜碱具有诱导肿瘤细胞凋亡作用。研究表明，石蒜碱能抑制结肠癌HT-29细胞的增殖，诱导肝癌HepG2细胞自噬〔7〕，诱导肺癌NCI-H460细胞凋亡作用〔8〕。但对OSCC细胞的抗肿瘤效果鲜有报道，本研究通过给药OSCC CAL-27细胞进行体外抗肿瘤研究，结果提示石蒜碱能通过下调Ki67和PCNA水平抑制OSCC CAL-27增殖；石蒜碱可诱导OSCC CAL-27细胞凋亡。Bcl-2为抗凋亡基因，而Bax为典型的促凋亡基因。提示石蒜碱能通过调控经典的Bcl-2/Bax信号通路启动线粒体凋亡，诱导OSCC CAL-27凋亡。石蒜碱调控癌细胞增殖与多种细胞机制有关，如调控细胞周期，促进细胞自噬达到细胞凋亡的目的〔7〕。也有研究显示，石蒜碱调控细胞增殖和凋亡与MAPK、Akt/smad信号通路密切相关〔9〕。文献显示，RACK1为MAPK、Akt信号通路上游的信号分子，下调RACK1的表达，可抑制Src/Akt 信号通路活性，抑制人胶质瘤细胞增殖、侵袭〔10〕。RACK1 为支架蛋白，通过调控细胞增殖、凋亡、迁移、转录和蛋白合成等影响癌细胞的进展。而且RACK1下调还与肺腺癌化疗的敏感性增加有关〔11〕。本研究结果说明石蒜碱抑制OSCC CAL-27细胞增殖，诱导细胞凋亡与调控RACK1 表达水平有关。而且通过进一步研究显示，采用siRNA下调RACK1 表达的表达水平后，石蒜碱抑制OSCC CAL-27细胞增殖，诱导细胞凋亡作用明显增强，这也进一步证明石蒜碱调控OSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的与调控RACK1表达水平有关。

总之，石蒜碱能通过调控RACK1的表达水平调控OSCC CAL-27增殖，诱导细胞凋亡，可以为口腔鳞癌的治疗提供新的靶点，同时也为石蒜碱的开发提供新的依据。