响应曲面法优化微波样品制备仪提取白及多糖工艺

杨晓丽，刘 里，丁梦娜，王秀连

(曲靖师范学院 化学与环境科学学院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

白及[1]味苦、甘涩、性微寒，是应用历史悠久的药食同源类中药.白及具有清热利湿、收敛止血、消肿生肌等功效，可治疗肺伤咳血、外伤、胃及消化道溃疡出血、烫火灼伤、皮肤皲裂等病症[2-3].白及也是一种良好的天然生物工程材料，无毒副作用、安全舒适、可降解、无污染.另外，白及还有减少刺激、保护皮肤、美白、延缓衰老等功效[4].白及主要功能性成分是多糖[5]，其他主要化学成分还包括联苄、菲衍生物，还含有少量的挥发油和粘液质[1].

已有文献考察了加水量、浸泡时间、水浴温度、提取时间、提取次数、醇沉浓度对白及多糖提取的影响[6-7].为了缩短提取时间，提升提取品质和效率，也尝试将超声[8-11]、酶解[12]、碱提[13]、微波协同技术[14]用于提取白及多糖.常用单因素[2]、正交试验设计[8]、响应曲面法[6]探究白及多糖的最佳提取方案.单因素法对每个实验参数孤立分析，简单直接，但无法获得参数间相互影响信息；正交试验设计对实验参数逐个水平进行分析，探讨参数对试验结果的影响；响应曲面法在优化实验参数的过程中可以连续分析并给出直观图形，克服了单因素和正交试验的孤立性[15].

微波提取技术具有提取效率高、节省时间、节省溶剂、节能、污染小等优点[16].近年微波提取技术逐渐用于多种药物、食品中多糖的提取[17-23].直接用微波提取白及多糖的报道较少.本文探讨了微波样品制备仪在提取白及多糖中的应用，并采用响应曲面法优化微波提取工艺.

1 材料与方法

1.1 材料

白及块茎来自于曲靖某农业公司，将新鲜块茎用清水洗净，切片，60℃鼓风干燥箱烘干，中药粉碎机粉碎，制样机制样，过80目筛.使用前60℃鼓风干燥箱烘干至恒重，置于干燥器中备用.

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

Multi-wave PRO 微波样品制备仪：安东帕；紫外可见分光光度计：瓦里安 cary50；电子天平：奥豪斯AR224CN；超声波清洗器：昆山超声KQ3200B；电热鼓风干燥箱：恒科DHG-9245A；高速中药粉碎机：百信 LG-100；数显恒温水浴锅：国华 HH-4；离心机：凯达 TD5A；制样粉碎机：开元 5E-PCIX100.

1.2.2 试剂

苯酚(重蒸)，浓硫酸，葡萄糖标准品，无水乙醇.

1.3 方法

1.3.1 提取工艺流程

精确称取混匀的白及块茎粉末0.2000g，加入一定的水做提取剂，震荡混匀样品；在设定的参数下采用微波样品制备仪进行多糖的提取；4000r / min离心10min得多糖提取液.

1.3.2 标准曲线

按照国标SNT4260-2015中的方法绘制标准曲线.

1.3.3 多糖物质含量的测定

精确移取2mL提取液，加入1mL 5g/L 淀粉酶，在60℃恒温水浴中水解1h，加入12mL无水乙醇，将多糖沉淀析出.4000r/min离心10min得多糖.用水溶解多糖并定容至50mL得待测液.取0.5mL待测液用国标SNT4260-2015中硫酸苯酚法进行显色反应，并以淀粉酶为空白在490nm处测定吸光度，根据标准曲线得待测液浓度并计算多糖提取率.

1.3.4 微波样品制备仪参数设定

结合仪器温度波动范围、仪器的压力等要求，multi-wave PRO 微波样品制备仪参数设置如表1.

表1 微波样品制备仪的参数设定

2 结果与讨论

所有实验均平行测定三次，结果为平均值.

2.1 葡萄糖标准曲线与换算因子

实验测得标准曲线见图1.

图1 葡萄糖标准曲线

吸光度标准曲线为：A=0.079289c-0.004988(相关系数r=0.9983)，A—吸光度、c—浓度(单位mg/L).回归分析结果表明，在2.8～14mg/L范围内葡萄糖的质量浓度和吸光度呈现良好线性关系.按照国标SNT4260-2015中的方法取多糖换算因子f=0.9.

2.2 单因素实验结果

2.2.1 液料比对白及块茎多糖提取的影响

固定功率100W、时间7min，液料比75～175mL/g，考察液料比对白及块茎多糖提取效果影响，结果见图2.

图2 液料比对白及块茎多糖提取影响

从图2可见，随着液料比增大，多糖提取率先提高后降低，整体波动在24.5%～26%范围内，波动幅度不大.推测液料比对白及块茎多糖提取影响较小.当液料比为75mL/g时，虽然由于多糖类物质的粘性可以使白及很好地分散和悬浮，但是当温度升高时，白及粉末易黏附在容器壁上，使得提取不完全.当液料比大于125mL/g后，提取液较稀，不易发生黏附容器的现象，但溶液的粘度降低，使白及粉末的分散性不好，易沉于底部，使多糖溶出受限.当液料比为100mL/g时，白及块茎多糖提取率最高.

2.2.2 微波功率比对白及块茎多糖提取的影响

固定微波时间7min、液料比100mL/g，微波功率50～150W，考察微波功率对白及块茎多糖提取效果影响，结果见图3.

从图3可见，随着微波功率从75W增大到100W，白及块茎多糖提取率快速提高而后降低.微波功率改变使得多糖提取率在21.5%～26%之间波动，波动范围较大.推测微波功率对多糖提取率影响较大.当微波功率为50W时，7min后提取液升温至64℃，微波功率和提取液温度均低，多糖溶出慢，提取率低.当微波功率为75W时，7min后提取液升温至83℃，多糖快速溶出.而当微波功率大于100W时，微波对多糖结构的破坏作用突出，使得多糖提取率降低.当微波功率为100W时，白及块茎多糖提取率最高.

图3 微波功率对白及块茎多糖提取影响

2.2.3 微波时间比对白及块茎多糖提取的影响

固定微波功率100W、液料比100mL/g，考察微波功率对白及块茎多糖提取效果影响，结果见图4.

图4 微波时间对白及块茎多糖提取影响

微波时间5min内，多糖提取率提升并不明显.考察提取液温度，3min后提取液温度升高至58℃，5min后提取液温度升高至83℃，之后微波时间的延长提取液都恒定在85℃.结合多糖提取率变化，发现温度提升范围内，多糖溶出增多但不快速.提取液温度稳定在85℃后，多糖开始快速溶出.当微波时间达到15min后，虽然提取液达到设定温度使得微波功率衰减，但微波对多糖的破坏作用开始突显，使得多糖提取率降低.

2.3 响应曲面法试验设计和统计分析

选择微波功率、微波时间、提取液料比(mL/g)三个实验参数.采用Box-Behnken模型设计响应曲面试验方案，表2中给出了各实验参数的高、中、低水平.

表2 微波样品制备仪提取白及块茎多糖实验参数水平及编码

采用MATLAB对实验数据进行二次回归分析.

2.4 模型的拟合

根据中心组合设计及结果(表3)，得到相应的二次拟合方程：

提取率Y/%=22.6689+0.7312A-0.01716B-0.01765C-0.01079A2+0.001391AB-0.004301AC-0.0002982B2+0.0005832BC-0.0000438C2

拟合模型方差分析结果见表4.从拟合模型方差分析结果可见，试验选用的模型极显著(p=0.0001)，失拟不显著p=0.3816，说明拟合模型恰当.模型的相关系数R2=0.9924.根据拟合模型失拟性分析可知所建立的三元二次回归方程拟合度较好，可以用于提取条件的估算.

表3 中心组合设计及结果

表4 中心组合设计二次拟合模型方差分析

拟合模型中各回归系数的显著性检验结果列于表5.

表5 二次拟合模型系数显著性检验

拟合模型系数显著性检验结果表明，各项因素均达到显著水平，说明实验参数均可以显著影响提取率.

2.5 实验参数的交叉影响

多元二次拟合方程所得的响应曲面图及对应等高线图，见图5～7.据此分析两因素的交互影响.

根据图5a可见，在7～11min范围内，随着微波时间的延长多糖提取率快速提高，随后提升缓慢.当微波时间和液料比确定的时候，微波功率提高使得多糖提取率略提高.从等高线图可见，微波功率较高使多糖提取率先提高后降低，可以在较短的时间范围内使多糖提取率提高，这是因为较强微波功率可以使得提取液温度快速升高到85℃，实现多糖快速溶出.当提取液温度升高到85℃后，微波功率会出现衰减，多糖溶出变慢.当微波时间过长的时候，微波对多糖结构的破坏作用将突显，使得溶出的多糖量反而减少.微波功率低于75W时，多糖溶出较慢且容易因为微波时间较长使得破坏作用突出.微波功率高于120W，也容易破坏多糖结构.

图5 微波时间与微波功率交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)

由图6a知，微波功率恒定时，液料比提高使得多糖提取率略有降低；随着微波时间的延长，多糖提取率得到提升.观察提取液，推测较小的液料比使得提取液粘稠，白及均匀分散，有利于多糖溶出.微波前期使得多糖快速溶出，之后再对提取液进行微波提取，使得提取出来的多糖结构被破坏.当微波功率较小时，微波时间的延长对多糖的溶出有明显促进作用.由图6b可见，较小的液料比有利于多糖提取.而液料比较大时，白及易沉淀在底部，不利于多糖溶出，即使延长微波时间也不能使多糖充分溶出.

图6 微波时间与液料比交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)

图7a表明，微波时间恒定为10min时，液料比的减小和微波功率的增加都会使多糖提取率出现小幅度提高，等高线也说明了这一点.等高线图还表明较小的液料比结合较低的微波功率有利于多糖的溶出.

图7 微波功率与液料比交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)

对比图5～7可见，微波时间的改变使得响应曲面变化幅度最大，说明微波时间长短对多糖提取影响最显著；微波功率影响居中；液料比的影响最小.较低的液料比、适当增加的微波功率和微波时间有利于白及多糖提取率的提高.

根据拟合曲线的优化结果，确定最优提取参数为微波时间15min、液料比75mL/g、微波功率100W，理论计算提取率为27.06%.用此参数进行5次平行验证性实验，实验提取率为(27.10±0.10)%，与预测值吻合.文献表明白及中多糖回流提取需要2.5～3小时[6]，酶解提取需要82min[12]，超声提取需要50min[9]，而本文采用微波提取仅需要15min.这也说明了微波技术可以更快速提取白及多糖.

为了考察微波快速提取白及块茎多糖的效率，应用最优提取参数进行三次提取，混合三次提取液，测定三次提取多糖总含量.平行测定三次，多糖提取率结果为：(28.43±0.22)%.一次即可提取出约95%的多糖.和文献报道的需要2～3次的提取[7]相比，微波提取一次即可提取完全，提取效率高.

3 结 论

用微波样品制备仪对白及块茎中的多糖进行快速提取.通过响应曲面得出微波时间、微波功率、液料比3个因素对多糖提取的影响主次顺序为：微波时间﹥微波功率﹥液料比.确定微波提取的最佳工艺为：微波时间15min、微波功率100W、液料比75mL/g.在此条件下多糖提取率达(27.10±0.10)%.一次可提取出约95%的多糖.结果表明微波样品制备仪用于白及块茎多糖提取方便快捷、提取时间短、效率高，是一种理想的提取方法.