药用植物重楼的分子生物学研究进展

孙 杰，吴章桥，何昌杰，叶媛丽，卓 蕾

（1 西南科技大学生命科学与工程学院/四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川绵阳 621010）

1 分子标记技术用于重楼鉴定的研究进展

目前，市场上正品重楼药材的混伪品较多，但由于其生长周期长，且不同种植物的根茎形态、组织结构较为相似，利用传统方法难以对其进行鉴定。而分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记技术，具有信息量大、重复性好、不易受外界环境影响等优点。现已用于重楼鉴定的分子标记技术有DNA 条形码、SSR 分子标记、CDDP 分子标记、SCoT 分子标记等技术及HPLC 指纹图谱，其中DNA 条形码技术的应用较为广泛。

1.1 基于DNA 条形码技术

姜黎等[2]采用DNA 条形码方法对36 份正品重楼及常见混伪品进行了检测，发现将ITS 全序列用作DNA 序列能快速区分其正伪，可用于重楼药材的鉴定。刘涛等[3]研究得出，35 份滇重楼样品的psbA-trnH序列用作DNA 序列，可作为一种鉴定滇重楼药材的新方法，且具有较好的稳定性和准确性。次年，方海兰等[4]首次将DNA 条形码技术用于重楼药材种子种苗的鉴定，结果表明，ITS 序列可有效鉴别正品重楼及其混伪品的种子种苗，能从源头上保证重楼药材种子种苗的真实性。研究结果再次证明了ITS 序列能有效鉴定不同重楼药材。刘立敏等[5]利用DNA 条形码技术结合HPLC 含量测定，有效区分了重楼属10 种药用植物，说明ITS2 序列可用于重楼药材的鉴定。同年，叶方等[6]对武当山重楼属植物进行种内分子的鉴定研究，也得出与之一致的结论，ITS2 序列作为DNA 条形码序列，可以将不同品种的重楼植物很好地区分开。并且，试验结果不支持宽叶重楼、狭叶重楼成为独立的变种，建议将其作为七叶一枝花的变形处理。次年，过立农等[7]将ITS 序列和ITS2 序列相结合，有效地将60 批栽培重楼样品鉴别到种，确定了样品中的10 个品种。刘杰等[8]利用DNA 条形码技术，确定重楼药材疑似伪品并非中国药典收录品种，并推断其基原为吉林延龄草，再一次证明了ITS2 序列和NJ 聚类树可有效鉴定重楼药材。

1.2 基于其他分子标记技术

袁会琼等[9]对云南重楼和长柱重楼共20 批重楼样品建立HPLC 指纹图谱，发现两者图谱相似度分别为0.905～0.998 和0.905～0.986，均可作为该重楼药材的标准指纹图谱。聚类分析和主成分分析结果均将两者明显区分，表明HPLC 指纹图谱可有效作用于重楼植物的品种鉴定且准确度较高，同时研究发现，相比于云南重楼，长柱重楼有效成分中重楼皂苷Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ含量更高。王海明等[10]基于RNA-seq 技术对14 份梵净山重楼块根进行转录组测序分析，开发出16 对可有效区分14 份梵净山重楼种质的SSR 引物，并且基于SSR标记的聚类图将14 个重楼种质聚类在2 个类群。周武先等[11]基于CDDP 分子标记完成了对13 份不同重楼品种的鉴定，并根据CODE128 条形码编码规则为该13 份重楼属药用植物构建了指纹图谱和条形码分子身份证，为快速鉴定重楼属植物提供了便利。程虎印等[12]基于SCoT 分子标记技术发现，陕西产重楼属中6个类群植物的SCoT 在种间和种内存在差异，表明SCoT 分子标记可用于重楼属植物的鉴定。

通过这些分子标记技术的开发和应用，不仅为重楼药材的鉴别提供了新的、准确有效的方法，还可以进一步防止市场上出现混伪品的现象，不断规范重楼药材的市场环境。

2 分子标记技术用于重楼遗传多样性的研究进展

种质资源研究是对药用植物遗传育种、资源保护及利用的重要前提，而遗传多样性研究是对其进行种质资源研究的重要内容，分子标记技术因其具有良好的适用性，在重楼药材遗传多样性研究中的应用也越来越普遍。

张晓瑞等[13]对4 个产地的17 份重楼样品进行分析，结果发现，ITS2 序列的遗传位点和聚类进化与重楼品种有关，并且不同地域环境对其遗传序列有重要影响。次年，周武先等[11]利用CDDP 分子标记发现13份重楼属种质资源遗传多样性丰富。程虎印等[10]采用SCoT 分子标记及UPGMA 分析得出6 种重楼属植物在物种水平上具有较高的遗传多样性，并对其进行了排序，由高到低依次为七叶一枝花、宽叶重楼、具柄重楼、狭叶重楼、宽瓣重楼和北重楼。同时，结果表明，七叶一枝花与北重楼为不同种群，支持将宽瓣重楼、宽叶重楼等划分变种的观点分类体系。Zhao 等[14]采用SCoT结合SRAP 的分子标记技术发现，达比山脉的33 个重楼植物遗传基础较窄，其种质资源遗传多样性丰富，并且发现SCoT 分子标记具有更高的标记效率和更高的多态性检测能力。Hoang 等[15]采用RAPD 技术调查发现，来自4 个生态区域的55 份重楼样本间遗传多样性有明显差异，且不同区域之间重楼遗传多样性水平较高（Gst=0.301）。Wang 等[16]研究确定的EST-SSR 标记可以作为重楼育种的标记之一，结果揭示了重楼种质资源适度的遗传多样性（He=0.527）和低遗传分化（Fst=0.103）。陈中苏直等[17]采用SSR 分子标记分析得出，云南省内5 个不同居群共115 份滇重楼样品具有较高的遗传多样性，且遗传变异主要发生在各居群内。吴喆等[18]采用FTIR 结合化学计量学的方法分析云南重楼及其近缘种的亲缘关系，结果发现，PLS-DA 分类效果更好，能将5 种野生重楼属植物准确区分，同时，云南重楼与南重楼和百花重楼之间的亲缘关系较近，而与毛重楼和五指莲的关系较远。Huang 等[19]基于AFLP 标记对15 个野生种群和17 个栽培品种进行遗传多样性分析，研究表明，在物种水平上，栽培品种遗传多样性高于野生种群，但大多数基因变异存在于各自种群中，并且贵州野生种群比云南种群表现出更丰富的遗传多样性。尹晓蛟等[20]对从13 份重楼属植物中选取的18 个表型性状进行分析，结果发现，重楼样品的16 个性状在各种质间达到显著或极显著差异水平；遗传多样性指数达1.88～2.66，类型丰富；经主成分分析发现，累计百分比高于85%的5 个主成分累计贡献率为88.918%，对重楼表型差异影响大；同时，性状相关性研究表明，对重楼产量起到决定性作用的根茎的长度、最大直径及其干质量均具有较高的多样性，这对在今后的育种工作中利用现有种质资源来提高重楼药材的产量潜力具有重要指导意义。

3 重楼基因组及转录组学的研究进展

基因组是一个物种所有遗传信息的总和。转录组广义上是指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合；狭义上是指所有mRNA 的集合。Liu 等[21]利用RNA-seq 技术分别对8 年生重楼和4 年生重楼的根的转录组进行分析，从其根细胞获得大约87577 个unigene，通过序列比对后发现了重楼植物产生类固醇的代谢途径，得出25 个单基因负责重楼植物体内皂素类固醇物质的合成的结论，为濒危植物重楼基因组的研究提供了宝贵数据。Wang 等[16]对重楼属植物进行Illumina HiSeq 2000 第二代高通量测序，从其根细胞共获得56095 条unigene，平均长度为202bp，其中49.7%的unigene 获得注释信息。结果表明，这些unigene 主要映射到重楼体内的碳水化合物代谢、能量代谢和二次代谢物生物合成途径，为今后对重楼根质继代谢物合成和种群遗传学的分子机制的研究提供了重要线索。Li 等[22]采用高通量测序分析法发现，从滇重楼种子及种皮中得到的1174 个miRNA 以直接或间接的调控模式参与滇重楼休眠种子的细胞、代谢及遗传信息的处理过程，这对进一步研究重楼属植物变种的种子休眠分子机制有重要意义。Guan 等[23]从重楼属植物指定的PpSMT1-1 和PpSMT1-2 中分别获得了SMT1 基因的全长序列，研究结果表明，PpSMT1-1 能催化环烯醇的转化，而PpSMT1-2 缺乏这种催化活性，SMT 2 种不同的组织表达模式揭示了在不同发育阶段重楼属植物的不同器官中存在的表达差异，并且发现类固醇化合物是重楼属植物中主要的活性物质，这为进一步开展重楼植物中类固醇化合物的生物合成途径的详细研究建立了基础。

4 总结与展望

重楼药材药用价值高，供不应求，但重楼药材混伪品充斥市场的现象严重，市场秩序较为混乱。研究发现，人为因素是造成滇重楼资源紧缺的直接原因之一[7]，应制止过度的采挖行为，同时应对生境较好的重楼居群加以保护，并通过不断地规范市场监督制度，保证重楼栖息地不被破坏和临床用药的安全。此外，分子标记技术在重楼属植物不同种质间的鉴别与遗传多样性分析方面的应用研究较为广泛，这对于打击市场上重楼药材的滥用和冒用，以及进一步研究分析与正品重楼亲缘关系相近的重楼种属，以扩大重楼药材的药源具有重要指导意义。但是，目前对于重楼药材的基因组、转录组及蛋白组学的研究相对较少，笔者认为可以结合现有研究结果加大在这些方面的研究力度，深入研究，以期为重楼种质育种和优质新品种的获得给予进一步指导。