基于网络药理学探究银杏叶治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变的机制△

张 梦 王欣玲

非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)是仅次于青光眼的第二常见的视神经病变[1]，一般在 50 岁以上的中老年人群发病，多发于57～65岁[2]。在美国，NAION发病率为(2.3～10.2)/100 000[3]。有报道显示，我国NAION的发病率为1/16 000[4]。因该病对患者视力损害以及生活影响极大，对其机制的研究显得十分重要。有文献报道，银杏叶可通过清除自由基、抗氧化、保护神经细胞等发挥药理作用[5]。目前已经将银杏叶应用于临床NAION患者的治疗，并发现其对患者的临床症状有明显的改善，但由于银杏叶成分复杂多样，作用机制尚未十分明确。

网络药理学从多角度对基因、代谢、蛋白相互作用网络整合调节，从分子层面揭示药物作用于复杂疾病的潜在机制[6-7]。 本研究便基于网络药理学，从银杏叶治疗NAION的主要活性成分和靶点出发，揭示银杏叶治疗NAION的潜在分子机制，供临床应用以及科学研究参考。

1 方法

1.1 药物活性成分和潜在靶点筛选在TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中以银杏叶为关键词进行检索，根据药代动力学参数，以药理活性的两个重要评价指标(口服生物利用度≥ 30%[8]和类药物≥ 0.18[9])为筛选条件，获得银杏叶的生物活性成分，并获得其潜在的蛋白质靶标。使用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)，限定条件为人源并已经过验证，将各个活性成分对应的靶点蛋白进行基因名的转换，用于进一步研究。

1.2 疾病靶点筛选通过GeneCards、OMIM、disgenet、drugbank、TTD、Digsee数据库分别获得NAION的作用靶点，去除重复值得到其主要作用靶点，同样经过Uniprot数据库进行基因名转换，删除未经过验证的无效靶点，得到NAION的潜在靶点基因。

1.3 获取疾病-药物交集基因利用Venn在线软件，输入银杏叶作用靶点以及NAION的潜在靶点基因，得到交叉靶点，以此作为银杏叶治疗NAION的潜在作用靶点，得到数据集。

1.4 蛋白相互作用网络的构建将上述交集基因导入STRING网络平台(https://string-db.org/)，将蛋白相互作用数据导入Cytoscape(version 3.8.2)软件对网络进行可视化，以构建蛋白网络图(PPI网络图)。

1.5 主要活性成分以及核心靶点的筛选通过Cytoscape 3.8.2 软件进行拓扑分析，利用Network Analyzer插件中三个重要参数：度值、介数中心性和中心接近度作为筛选标准，参数较高的节点视为关键节点，从而筛选出Hub靶点基因集，构成Hub集。利用CytoHubba插件，选取MCC为最优算法[10]筛选出靶点基因集，构成MCC集。利用MCODE插件进行聚类分析，筛选出各个功能模块所涉及的靶点基因集，构成MCODE集。以上三种方法得到的交集基因即为核心靶点，其对应的药物成分认为是产生药效的主要活性成分。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用DAVID在线数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行生物富集分析，其包括GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。将药物和疾病交集靶点导入该数据库，以P<0.05、错误检出率(FDR)<0.05为显著性阈值，预测银杏叶治疗NAION的可能机制。

1.7 构建药材-化合物-靶点-通路网络图通过KEGG通路富集分析得到银杏叶作用NAION的主要通路以及对应的靶点基因，导入Cytoscape-3.8.2中进行可视化，得到药材-化合物-靶点-通路网络图，并对网络图进行分析，得到其中作用程度较大的通路，视为银杏叶治疗NAION的主要信号通路。

1.8 分子对接验证为进一步了解药物活性成分和核心靶点之间相互作用程度并深入了解其分子对接情况，将1.1得到的银杏叶主要活性成分在TCMSP数据库中检索其分子结构，并在Chemoffice 3D(2019版)中进行能量最小化等优化处理后，保存为mol2格式。再从Uniprot数据库中得到核心靶点蛋白的结构，并从RCSB PDB 数据库筛选含有配体分子(不包括离子和复杂结构)、分辨率高且蛋白链数少的3D 分子结构下载并保存为pdb 格式。最后利用SYBYL-X 2.0软件构建活性成分的分子表单数据库，对靶点蛋白做删除无效配体、分配电荷、去结晶水、加氢等前处理，选择与小分子相似的配体作为活性口袋位点，将其与活性成分的分子表单数据库进行分子对接，通过Total Score对对接结果进行分析，对接复合物的稳定性与该值大小呈正比，该值越大，说明化合物与受体的结合程度越好[11]。

2 结果

2.1 银杏叶中活性成分与靶蛋白的筛选从TCMSP分析平台得到银杏叶中307种有效成分，并根据药代动力学参数筛选标准，得到银杏叶中27个化合物符合标准，其中有7个成分无靶点，故得到20个活性成分(表1)。利用UniProt 数据库校正并保留有效数据之后则得到20个活性成分的521个靶点。其中靶点最多的前5个化合物分别为：槲皮素、山奈酚、毛地黄黄酮、β-谷甾醇、异鼠李素。

表1 银杏叶中主要化合物以及其药代动力学参数

2.2 NAION靶点筛选通过GeneCards、OMIM、disgenet、drugbank、TTD、Digsee数据库分别获得NAION的作用靶点，去除重复值后得到756个主要作用靶点。

2.3 药物和疾病靶点的交集将得到的药物靶点与疾病靶点通过Venny2.1软件作图工具平台取交集，得到银杏叶和NAION的共同作用靶点26个。

2.4 PPI网络构建将26种疾病与药物的交叉靶点导入String数据库，调节参数：物种限制为 “Homo sapiens”，设定最低蛋白相互作用阈值为中等可信度(可信度>0.400)，隐藏网络中无关联节点，获得蛋白质相互作用信息，该网络图中有26个节点、114条边，每个节点连接的靶点数目越多，代表此靶点越重要，可能成为核心靶点。

将上述蛋白质相互作用数据信息导入Cytoscape中。度值大小决定节点面积大小以及颜色深浅，节点面积越大、颜色越深则代表该靶点在蛋白质相互作用网络中越重要，节点的平均值为8.77(图1)。

图1 基于Cytoscape软件的PPI网络图

2.5 主要活性成分和靶点的筛选在Cytoscape-v3.8.2中对PPI网络图使用Network Analyzer工具行拓扑分析，利用Excel获取拓扑参数度值、介数中心性和中心接近度的中位数分别是9.5、0.025、0.59，并筛选出大于其中位数的靶点构成Hub集。

在CytoHubba插件拓扑分析中有12种算法，选择MCC为最优算法，筛选出排名前1/2的靶点基因12个，排名由高到低分别为：VEGFA、RELA、JUN、EGF、FOS、ESR1、MMP2、HIF1A、MYC、NOS3、APP、IL2，构成MCC集。

同样利用MCODE插件对 PPI 网络进行聚类分析，默认参数设置识别出3个蛋白质模块，同一蛋白质模块中的蛋白质靶点相互作用更紧密且功能特征相近，共涉及关键靶点24个，构成MCODE集(表2)。其中MCODE1中有12个节点和58条边,核心节点为NOS3，剩余节点围绕其聚集，MCODE1的分数为10.545，为三个模块中分数最高的蛋白模块，可认为最主要核心和功能靶点在此聚集。

表2 PPI网络节点聚集分析结果

将以上3种方法筛选出的核心靶点导入在线网络平台Venny2.1得到三者的交集，筛选出交集靶点共8个，分别为VEGFA、JUN、EGF、RELA、APP、ESR1、FOS、MYS，经过Uniprot数据库校正并得到银杏叶治疗NAION的主要靶点。

2.6 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析利用 David 数据库对银杏叶治疗NAION的26个交集靶点进行GO功能富集分析(P<0.05、FDR <0.05)，共得到62条信号通路，其中生物过程19条、细胞成分12条、分子功能31条(图2列出了生物过程、细胞成分和分子功能中的前10个条目)，发现银杏叶治疗NAION的交集靶点GO功能富集分析主要涉及血管生成反应、RNA聚合酶II启动子转录正调控、血小板活化反应、应对缺氧等，参与细胞膜、转录因子复合体、细胞空隙以及滑面内质网等细胞组分，以及参与酶结合、转录因子结合、蛋白质结合、生长因子结合、一氧化氮合酶活性等分子功能。

图2 GO功能富集分析

对银杏叶与NAION的共同靶点进行KEGG通路富集分析(P<0.05、FDR <0.05)，得到77条信号通路，其中前15条富集结果利用R语言软件进行可视化(图3)。富集基因数和P值决定节点的颜色与大小，颜色从红色到紫色代表P值从小到大，节点从大到小代表富集基因数从多到少，FDR与相关联基因数呈反比。筛选出用于研究内容相关的信号通路，结果显示，银杏叶主要通过癌症通路、癌症中胆碱代谢信号通路、T细胞受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等多条通路对NAION起作用，通路上涉及的靶点越多则代表该通路在银杏叶治疗NAION过程中发挥作用的可能性越大。

图3 KEGG通路富集分析气泡图

2.7 药材-化合物-靶点-通路网络图将银杏叶与NAION的交集靶点导入Cytoscape中，得到药材-化合物-靶点-通路网络(图4)，图4中红色v形代表药物，浅紫色椭圆代表银杏叶主要化合物，绿色菱形代表银杏叶与NAION的交集靶点，橙色四边形代表KEGG通路。网络中节点越大代表此化合物、靶点或通路在相互作用网络图中越重要。可见图中节点数量有112个，386条边，平均相邻节点数量为6.86。在化合物中节点最大的为槲皮素、毛地黄黄酮以及山奈酚，提示银杏叶可能通过槲皮素等化合物起到治疗NAION的作用。此网络中度值排名前5的靶点为PIK3CG、PRKCA、PRKCB、RELA、VEGFA。KEGG网络通路中节点度值靠前的有癌症通路、T细胞受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等，提示银杏叶可能通过这几条通路对NAION起治疗作用。

图4 药材-化合物-靶点-通路

2.8 分子对接模拟验证基于 SYBYL2.0软件，将银杏叶20个主要化合物与8个核心靶点蛋白进行对接计算，以更直接的方式检验化合物与靶蛋白之间的分子对接紧密性，经筛选，5个化合物与7个核心靶点对接结果良好，而与FOS靶点结合程度不佳。总分越高则代表分子与靶标之间结合程度越好，总分>4.25分表示有结合活性，总分>5.00分表示有良好的结合活性，总分>7.00分则表示有较强的结合活性[12](表3)。

表3 与靶标结合良好的化合物数量及其靶标生物效应

3 讨论

NAION为供应筛板前区及筛板区的睫状后血管的小分支发生缺血，致使视盘发生局部梗死，以致患者突发单侧视力丧失，无疼痛，但伴有典型的视野缺损(与生理盲点相连的扇形缺损)[13]。长期以来，临床上对NAION的治疗一直以西医为主，且大部分临床医生以经验治疗为主，国际上目前尚无公认、有效的治疗方案。除此之外，NAION的发病机制同样存在争议。有研究显示，视神经缺血后导致视盘充血、水肿,进而释放炎症因子,导致视神经进一步损伤[14-15]。同样有研究推测，视神经受到缺血缺氧的刺激后,启动了细胞凋亡机制,造成视网膜神经节细胞的数量减少,从而进一步导致视功能的损伤[16]。

银杏叶主要含黄酮类化合物及萜类成分，为银杏科植物的干燥叶，主归心、肺经，味甘、苦、涩，性质平和。《中药志》记载：银杏叶可以收敛肺气，止咳平喘[17]。中药药理学研究显示，银杏叶的治疗作用较为广泛，如改善心血管及周围循环功能，改善心肌缺血，促进记忆力、改善脑功能等。此外，银杏叶还具有降低血液黏稠程度及有效清除氧自由基的功效[18]。目前，银杏叶也逐渐用于NAION的治疗，但其详细的治疗机制尚不明确。故基于网络药理学分析银杏叶单味中药在治疗NAION中的作用机制和关键通路有重要意义。

本研究基于网络药理学方法，检索到银杏叶包含的20个活性化合物的521个靶点，与NAION的756个疾病相关靶点进行基因映射，获得26个映射基因，构建了蛋白质相互作用网络。银杏叶中槲皮素、山柰酚和毛地黄黄酮几个成分自由度较高，表明这几个成分在治疗NAION方面起主要作用。现代药理学研究表明，槲皮素能够清除超氧自由基并减轻氧化应激的损伤，还可以通过降低对炎症因子的反应和抑制细胞凋亡来发挥抗炎和抗凋亡作用[19]，与此同时，槲皮素还可以舒张血管，继而起到治疗NAION的效果[20]。山奈酚与木犀草素也具有抗炎与抗氧化作用[21]，且与本研究结果相一致的是，木犀草素在脑内神经缺血缺氧过程中可减轻神经炎症并有神经保护的作用[22-23]。

在蛋白相互作用网络中经过三种方法的筛选并相互整合，得到银杏叶治疗NAION的核心靶点基因：VEGFA、JUN、EGF、RELA、APP、ESR1、FOS、MYC;银杏叶主要通过这几个核心靶点治疗NAION。由于NAION主要机制为睫状后短动脉供应不足引起的视盘循环的短暂破坏导致灌注不足和缺血，有研究表明[24-25]，VEGFA、EGF在缺血缺氧环境中可诱导血管内皮细胞的生成并促使血管通透性的增加。在NAION的病理过程中，缺血缺氧则会使细胞处于氧化应激的状态，促使细胞内释放大量的炎症因子，MYC基因与RELA基因在炎症反应中发挥着重要的作用。RelA/p65是NF-κB复合体，有研究指出，凋亡的视网膜神经节细胞(RGC)中NF-κB和TNF-α的表达增加[26]。抑制AMPK、激活和刺激HCAR1-ARRB2信号转导可减少NF-κB和TNF-α的表达增加，具有抗炎和神经保护作用[27]。MYC基因是较早发现的一组癌基因,有研究发现，N-Myc下游调控基因(NDRG)在囊泡运输、应激反应以及神经再生等方面具有明显的作用[19]。 对于APP、FOS、ESR1，均有报道显示它们参与神经疾病损伤的病理过程[28-29]，在神经元细胞的兴奋性以及神经元细胞的可塑性和突触的可塑性方面起着重要的神经保护作用[30-33]。综上，银杏叶通过多靶点参与缺血缺氧、氧化应激以及炎症等病理过程以治疗NAION。

KEGG通路富集分析发现，银杏叶治疗NAION涉及多条信号转导通路，这些通路主要使RGC适应缺血缺氧的环境，并产生细胞保护因子以延长RGC的寿命，减少凋亡。在诸多通路中，癌症信号通路排第一，其中最为典型的可有Wnt信号通路[34]。研究表明，高水平的Norrin和随后在RGC中Wnt/β-catenin信号转导的激活可防止通过IGF-1引起的视神经轴突损伤，从而引起PI3K-Akt信号转导的活性增加；并且Norrin可减轻青光眼小鼠模型中RGC及其轴突的慢性损伤，从而起到一定的保护RGC的作用[35]。这与本研究结果相一致，即银杏叶通过提高Norrin蛋白的表达，减轻因缺血而造成的RGC的损伤。此外本研究还显示，银杏叶治疗NAION过程中涉及PI3K-Akt信号通路，这与之前报道的提高PI3K-Akt信号通路以及相关蛋白且提高缺氧诱导因子-1α的表达可以提高组织对缺血缺氧的适应相符合[36-38]。而Wang等[39]研究显示，抑制MAPK信号通路可以有效地改善缺血缺氧造成的神经元细胞的凋亡与损伤，并能促进神经元细胞的功能修复。

综上，本研究应用网络药理学方法探究了银杏叶活性成分治疗NAION的潜在作用机制。结果发现，银杏叶可通过多成分、多靶点、多途径对NAION发挥治疗作用。与以往的传统药理学研究相比，本文基于网络药理学的相关研究获得了一定的突破，为后期围绕预测得到的化合物、作用靶点及信号通路进一步深入探究银杏叶治疗NAION机制的实验验证开辟新思路。