奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的体外毒力比较研究

江晓晗 ， 胡 宜 ， 程 佳 ， 朱春燕 ， 刘 钢 ， 韩 博 ， 高 健

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 上海市农产品质量安全中心 ， 上海 青浦 201708)

前期的流行病学调查结果显示，克雷伯菌是引起我国大型奶牛场中临床乳房炎的最常见致病菌之一，分离率为13.0%，仅次于大肠杆菌(14.4%)[1]。克雷伯菌性乳房炎临床症状一般较为严重，和大肠杆菌相比，产奶量损失的发生时间较早,持续时间较长，严重程度更高[2-3]。最近的研究结果显示，引起奶牛临床乳房炎的克雷伯菌主要是肺炎克雷伯菌(51.0%)和产酸克雷伯菌(49.0%)，两者分离率相当[4]。两种乳房炎源性克雷伯菌对关键毒力基因的携带率存在差异，但克雷伯菌对乳房炎的致病力不仅仅与毒力基因的携带情况有关，生长状况等也会影响炎症反应程度[5]。此外，细菌对乳腺上皮细胞的黏附和侵袭能力在乳房炎的发病机理中起着重要作用[6]。克雷伯菌的黏附和侵袭能力促进了急性乳房炎的发病，并可能导致急性乳腺炎向慢性感染转归[7]； 克雷伯菌的细胞毒性作用[乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放量]也反映了致使组织损伤的程度[8]。因此，在前期的流行病学调查基础上，本试验选择了临床乳房炎源性肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌各5株，旨在通过对比2种细菌体外生长状况、对乳腺上皮细胞的黏附、侵袭能力及致细胞损伤能力，初步探索两者的体外毒力差异。

1 材料与方法

1.1 菌株与细胞 本试验所用的肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌均来源于奶牛临床乳房炎奶样，患病奶牛均出现了较为明显的乳汁和乳房异常变化(乳汁呈水状、絮状、结块、黏稠等；乳房呈红、热、肿、痛等)。牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells,bMECs)，购自上海金马生物制品有限公司，于液氮罐中冷冻保存。

1.2 试剂 MHB肉汤和LB营养琼脂平板，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；内毒素(Lipopolysaccharides,LPS)ELISA检测试剂盒，购自北京华佰泰生物科技有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。

1.3 克雷伯菌生长曲线测定 分别挑取5株肺炎克雷伯菌、5株产酸克雷伯菌的单菌落于含有1 mL MHB肉汤的离心管中，37 ℃恒温摇床上220 r/min振荡培养8 h。吸取50 μL菌液，与50 mL MHB培养液混合于50 mL离心管，于37 ℃恒温摇床上220 r/min 振荡培养，每隔1 h取1 mL培养液，用分光光度计测OD600值。以时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制生长曲线。

1.4 克雷伯菌内毒素(LPS)测定 分别挑取5株肺炎克雷伯菌、5株产酸克雷伯菌的单菌落于含1 mL MHB肉汤的离心管中，37 ℃恒温摇床上220 r/min 振荡培养12 h。吸取10 μL菌液，与1 mL MHB培养液混合于离心管中，置37 ℃恒温摇床上220 r/min振荡培养2、4、6、8 h和10 h，每个时间点设置3次重复。按固定的培养时间取出离心管，3 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，用内毒素ELISA检测试剂盒进行检测。

1.5 细菌感染bMECs 将复苏的bMECs按照0.5 mL/孔 接种到24孔板上，摇匀，于5% CO2培养箱中37 ℃下培养24 h，吸出细胞培养液，每孔用PBS洗涤2次。按照MOI=5∶1，每孔加入由DMEM/HIGH GLUCOSE培养基稀释的克雷伯菌悬液，每株菌设置2个重复，于5% CO2培养箱中37 ℃ 下培养。分别于感染后2、4 h和8 h取样。

1.6 克雷伯菌对bMECs的黏附力测定 取出上述感染细胞，吸出细胞培养液(即非黏附细菌)，每孔用500 μL PBS洗3次，然后每孔加入100 μL胰蛋白酶(含 EDTA)，于37 ℃、5% CO2培养箱中消化1.5 min后，每孔加入100 μL DMEM和血清混合液，将细胞完全吹打下来。将2个孔中的细胞悬液加入1.5 mL离心管。用PBS进行连续10倍倍比稀释，取10 μL稀释液接种于LB琼脂板上，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，进行菌落计数。

1.7 克雷伯菌对bMECs的侵袭力测定 取出感染细胞后，每孔用500 μL PBS洗涤3次，加250 μL浓度为50 μg/mL的卡那霉素溶液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h，杀死位于细胞外的细菌。取出细胞，吸出上清液，每孔用500 μL PBS洗涤3次后，加入250 μL PBS和250 μL 1% Triton X-100(v/v)裂解细胞，室温静置10 min，释放侵袭细菌，再次反复吹打混匀。取出细胞裂解悬液，用 PBS 进行连续10倍倍比稀释，取10 μL稀释液接种于LB琼脂板，37 ℃ 培养箱中培养24 h，进行菌落计数。

1.8 LDH测定 细菌感染步骤同1.5。分别于2、4 h 和8 h取出细胞板，吸出上层细胞培养液，每孔用PBS洗2次，后向每孔中加入500 μL DMEM，再放入培养箱中培养2 h取样，以减少DMEM细胞培养液的pH对检测结果的影响。取上层细胞培养液8 000 r/min离心10 min，取上清液，用LDH试剂盒进行检测。于每个时间段分别设置2个空白对照孔。

1.9 统计学方法 采用SPSS 25.0的独立样本t检 验和单因素方差分析(One-way, ANOVA)进行显著性分析。当P<0.05时，判定为具有统计学差异。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的体外生长曲线 结果见图1。肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌在MHB肉汤中2 h后进入对数生长期，对数生长期可持续6 h。在对数生长阶段，肺炎克雷伯菌的生长速度大于产酸克雷伯菌。

图1 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌体外生长曲线Fig.1 Growth curve of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca

2.2 LPS释放量 如图2所示，在4、8 h和10 h肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的LPS释放量均无显著差异(P>0.05)。但肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌于10 h的LPS释放量极显著高于8 h的释放量(P<0.01)。

图2 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌LPS释放量Fig.2 LPS release by Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca同上一时间点相比， **:P<0.01;下图同Compared with the previous time point, **:P<0.01. The same as below

2.3 克雷伯菌对bMECs的黏附力和侵袭力 如图3所示，在2、4 h和8 h肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌对bMECs的黏附数和侵袭数无显著差异(P>0.05)，而在8 h时，2种克雷伯菌的黏附数和侵袭数均显著高于4 h(P<0.01)。

图3 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌对bMECs黏附力(A)和侵袭力(B)对比Fig.3 Comparison of adhesion(A) and invasion(B) of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca to bMECs

2.4 克雷伯菌对bMECs的毒性作用 如图4所示，在肺炎克雷伯菌组和产酸克雷伯菌感染组，bMECs在4 h和8 h时的LDH释放量均极显著高于对照组(P<0.01)。随感染时间的延长，LDH释放量逐渐升高，在2种细菌感染后4 h和8 h，bMECs的LDH释放量较前一检测时间点均有极明显升高(P<0.01)。然而，在肺炎克雷伯组和产酸克雷伯菌感染组，2、4 h和8 h时引起的bMECs的LDH释放量未见差异(P>0.05)。

图4 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌感染bMECs后LDH释放量Fig.4 LDH release quantity of bMECs induced by Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca与对照组相比， **：P<0.01Compared with the control group, **:P<0.01

3 讨论

在前期的流行病学调查中，我们从奶牛临床乳房炎的奶样中共收集到了124株肺炎克雷伯菌和117株产酸克雷伯菌。在本试验中，分别选择了5株 肺炎克雷伯菌和5株产酸克雷伯菌，在一定程度上能够降低对比试验的偶然性，提升准确性。

肺炎克雷伯菌的对数生长期速度快于产酸克雷伯菌，提示在早期感染阶段肺炎克雷伯菌在乳房内的繁殖速度可能强于产酸克雷伯菌。LPS 是革兰阴性菌外膜的主要成分，在细菌死亡后释放到环境中。已有试验表明，细菌生长迅速时，细菌自然死亡能使内毒素释放增加[9]。在体外培养条件下，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌在相同时间内，细菌自然死亡释放的LPS量无显著差异；但随着体外培养时间的增长，自然死亡细菌增加，LPS释放会随之增多，故LPS的释放量可用于评估细菌的生长状况。并且少量的 LPS 可以通过刺激免疫系统而作为一种保护性的化合物[10-11]；大量的LPS会引起高烧、增加心率,并导致肺部和肾功能衰竭、血管内凝血和系统性炎症反应[12]。因此，可进一步研究细菌在体内作用时LPS增多引起炎症反应加重的具体情况。

乳腺上皮细胞是乳腺组织中重要的泌乳细胞，是病原菌穿过乳头管机械屏障后进入机体内部之前最先接触的细胞[13]。克雷伯菌具有黏附和侵袭乳腺细胞的能力[14]。肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌在感染奶牛乳腺细胞后的2、4 h和8 h，对于细胞的黏附数并无显著差异。两种克雷伯菌对细胞的黏附数在感染8 h后均有大幅度的上升。可以得出，克雷伯菌对细胞的黏附有一定的时间依赖性。在感染2、4 h和8 h，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌侵袭进入细胞的数量无显著差异，且侵袭数量极低。但在感染8 h后，细菌的侵袭数量显著增加。可以得出，两种克雷伯菌对乳腺上皮细胞的侵袭也有一定的时间依赖性，这与以往试验结果相符[15-16]。

LDH 是存在于细胞浆中，由活细胞合成的一种酶类，其活性随着乳房炎严重程度的增加而呈现明显的上升趋势[15]，可作为评估乳房健康状况的指标之一[16]。因此，本试验根据细胞培养液中 LDH 释放量的变化判断乳腺细胞的损伤程度。感染4 h后，两种克雷伯菌侵染的细胞LDH释放量显著高于空白组，说明开始引起严重的细胞损伤；结合感染后8 h才出现了黏附力和侵袭力的增强，推测在克雷伯菌乳房炎出现临床症状后，通过抗生素治疗及时清除胞外细菌控制慢性感染，在时间上具有可行性。尽管在感染后8 h肺炎克雷伯菌感染组的乳腺上皮细胞LDH释放量与产酸克雷伯菌组无显著差异(P=0.089)，但较低的P值提示，在未来的研究中仍需对比两种细菌在乳腺组织内引发的炎性反应强度。本试验中，体外细胞感染模型中肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌对乳房上皮细胞的侵袭率较低。此外，黏附率和LDH的释放具有同步性，而侵袭率与LDH的释放无明显相关性。以上结果提示，克雷伯菌的侵袭作用可能不是影响其引起严重急性炎症反应的关键因素，与Anaya等的研究结果相似[17]。但最新研究显示，在小鼠体内乳腺模型中，细菌乳腺上皮细胞的黏附和侵袭有助于乳房炎发病[7]，提示后续研究应从体内模型进一步探索克雷伯菌性乳房炎的致病机理。