SARS-CoV-2核酸检测的现状和问题

2021-12-07张春燕潘柏申王蓓丽

检验医学 2021年5期

黄斐，张春燕，郭玮，潘柏申，王蓓丽

（1. 复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；2. 复旦大学附属中山医院厦门医院检验科，福建厦门 361005）

截至2021年4月30日，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）全球累计确诊超过15 000余万例。经呼吸道飞沫和密切接触传播是SARS-CoV-2主要的传播途径。多个研究团队估算SARS-CoV-2基本再生率（basic reproductive rate，R0）为1.8～6.47，远高于严重急性呼吸综合征冠状病毒（R0为2.0～3.0）和其他流感病毒，提示SARSCoV-2的人际传播速度更快[1-2]。无症状感染者和轻型COVID-19患者具有一定传染性，若未及时检出并加以控制，会加速病毒传播。

我国《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》指出，SARS-CoV-2核酸检测是确诊COVID-19的金标准[3]。准确的实验室核酸检测结果在病毒感染诊断和疫情防控中起着重要的作用。然而与临床症状、影像学特征不相符的SARS-CoV-2核酸检测假阴性结果会影响临床诊疗，延误疫情防控。相较于假阴性结果，假阳性结果较少见。假阳性结果不仅浪费医疗资源，还会引起不必要的社会恐慌。本文围绕SARS-CoV-2核酸检测的影响因素，探讨其在临床检测实践中存在的问题，以期能帮助临床实验室规范和精准地开展SARS-CoV-2核酸检测。

1 分析前

分析前阶段影响因素是临床检测错误的主要来源，错误率约占检测全过程全部错误的46.0%～68.2%[4]。样本类型、样本采集和样本灭活等分析前因素对检测结果会产生一定的影响。

1.1 样本类型

呼吸道（上/下呼吸道）样本是最常用于诊断COVID-19和疗效监测的样本类型。有研究从粪便样本中不仅检出SARS-CoV-2核酸，同时分离培养出活SARS-CoV-2[5]。有荟萃分析发现，约43.7%的COVID-19患者的粪便中可检出SARSCoV-2核酸，其中包括部分无胃肠道症状的患者[6-7]。此外，唾液也被证实可作为SARS-CoV-2核酸检测可靠的样本类型[8]。

样本中的病毒载量与采集部位有关。有研究发现，下呼吸道样本的核酸检测阳性率和病毒载量远高于上呼吸道样本，不同样本类型SARS-CoV-2核酸检测阳性率一般为肺泡灌洗液>痰液>鼻咽拭子>口咽拭子[9]，呼吸道样本的核酸检测阳性率和病毒载量远高于非呼吸样本[10]。

不同部位（类型）样本病毒载量的动态变化与疾病进程有关。SARS-CoV-2通过血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受体和跨膜丝氨酸蛋白酶2（transmembrane protease serine 2，TMPRSS2）侵入宿主细胞[11]。SUNGNAK等[12]对不同器官组织的单细胞RNA测序图谱进行分析，发现ACE2受体和TMPRSS2在鼻杯状细胞和纤毛细胞中高表达，证实鼻腔是感染发生的初始部位，这也解释了鼻拭子中病毒载量显著高于咽拭子的原因。COVID-19患者在出现症状的1周内，上呼吸道样本中的病毒载量达峰值；下呼吸道样本中的病毒载量达峰值稍晚（症状发作2周内），但病毒持续时间长，且病毒载量远高于上呼吸道样本；粪便样本中的病毒载量在病程后期（症状发作后3～4周）达峰值（症状发作后3～4周），但其病毒持续时间（22 d）显著长于上/下呼吸道样本（18 d）。对不同患者的分层分析发现，重型和危重型COVID-19患者呼吸道样本中病毒的持续时间显著长于轻型和普通型COVID-19患者，但病毒载量无显著差异[13]。因此，对于急性期COVID-19患者应采集其呼吸道样本；重型及危重型COVID-19患者优先采集其下呼吸道样本；疾病后期可附加采集粪便样本（用于监测疾病恢复情况）；对于无症状感染者和普通人群筛查建议优先采集鼻咽拭子，口咽拭子次之。多类型（部位）样本联合检测能更有效地避免出现假阴性结果。

1.2 样本采集

由不规范的采样程序（如使用错误的拭子、采样部位不准确、分泌物吸取量不足，交叉污染等）获得的不合格呼吸道样本是产生假阴性核酸检测结果的重要原因。

美国疾病预防控制中心建议采用塑料杆的涤纶或人造棉拭子（如聚酯纤维拭子）采集鼻咽和口咽样本，藻酸钙或木杆拭子会使病毒失活或抑制聚合酶链反应[14]。采样人员应根据患者类型做好相应的个人防护，对疑似和确诊COVID-19患者应采取三级生物安全防护，对一般患者可采取二级生物安全防护，严格遵守生物安全要求。样本采集前的准备工作极为重要，正确的准备工作可减少黏液和其他干扰物对后续检测结果的影响。鼻咽样本采集前，被采集人员需用纸巾清除鼻腔内多余分泌物，拭子进入方向与上颚平行，到达鼻咽底部轻轻旋转1周后缓慢取出；口咽样本采集前，被采集人员需用0.9%NaCl溶液漱口，拭子用无菌0.9%NaCl溶液湿润后越过舌根，在双侧咽扁桃体和咽后壁擦拭至少3次。鼻咽和口咽拭子采集后均需保存于含2～3 mL病毒保存液的螺口管中。采样人员应经专业培训，确保熟练掌握规范采样技术，为开展准确的SARS-CoV-2核酸检测奠定基础。

1.3 样本灭活

为保证操作人员的安全，《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）》建议在检测前对各类临床样本进行预灭活[15]。常见的预灭活方式包括热灭活和化学灭活。在临床实践过程中，学者们对临床样本是否需要预灭活以及如何预灭活产生了争议。多项研究结果显示，预灭活是造成核酸检测结果假阴性的原因之一[16-19]。PAN等[17]研究了热灭活（56 ℃ 30 min）对病毒核酸检测结果的影响，发现低病毒载量的样本（循环阈值值为33.37～36.89）对热灭活敏感，46.7%的弱阳性样本经热灭活后转为阴性[17]。低温热灭活也会破坏单链RNA的完整性，导致产生假阴性或假性减低的结果。灭活有效性取决于病毒能否复制。JUREKA等[18]通过病毒空斑试验发现，56 ℃ 30 min无法完全灭活高病毒载量样本中的病毒（1×106pfu/mL），通过延长灭活时间（1 h）才能达到灭活要求。但延长灭活时间至1 h，会增加2.3%的假阴性结果[19]。化学灭活（含胍盐）被证实能有效灭活病毒，且对检测结果影响较小，但该灭活程序将限制后续核酸检测方法的选择，并会造成环境污染[17]。

预灭活会对检测结果产生不同程度的影响。临床实验室采取切实有效的个人防护措施比检测样本的预灭活更为重要。世界卫生组织强调，正确使用生物安全柜是开展SARS-CoV-2检测实验室生物安全防护的核心要求。在二级生物安全实验室中，采取适当的三级个人防护，如连体防护服、护目镜（面罩）、N95口罩、手套等装备，严格在生物安全柜中进行高风险操作，可完全保障操作人员的安全。世界卫生组织同时建议，检测实验室可选择附移液功能的封闭式自动化核酸抽提仪，减少人工操作。因缺乏防护物资，选择检测样本预灭活方式的实验室，建议制定实验室检测样本预灭活方式的标准化操作流程，完成相应的性能验证（即使是有文献报道的预灭活程序），确保实验室了解预灭活程序对检测结果的影响[20]。

2 分析中

尽管目前临床实验室选用的检测试剂盒都是获得管理部门批准的，但选用前仍需比较不同品牌试剂盒的检测靶标和检测方法，完成详尽的性能验证。检测过程中的全流程质量管理、日常质量控制和定期室间质量评价也是保证检测质量的关键。

2.1 检测靶标

检测目标区域的选择对SARS-CoV-2核酸检测至关重要。SARS-CoV-2含有约29 000个碱基，有12个蛋白编码区/开放读码框（open reading frame，ORF），包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14，其中ORF 1ab为RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）基因所在区域，编码RNA聚合酶，负责病毒核酸复制；S区编码棘突蛋白，与病毒感染能力相关；E区编码囊膜蛋白，负责病毒包膜及病毒颗粒的形成；M区编码膜蛋白；N区编码核衣壳蛋白，可与病毒基因组宿主RNA互相识别。SARS-CoV-2的RdRp基因在进化树上与严重呼吸综合征冠状病毒显著不同，且N和S基因与其他蝙蝠相关病毒的同源性低，因此这些基因可作为特异性标志物[16]。E基因与其他冠状病毒高度相似，仅可作为筛查标志物[21]。

常见的临床检测试剂可分为单靶标和多靶标（双靶标和三靶标）2种。单靶标使用1组引物和探针靶向SARS-CoV-2单个基因区域，而多靶标则使用多组引物和探针检测多个基因区域。我国获批的检测试剂盒主要针对ORF1ab、N和E基因。大部分获批试剂盒使用内标监控质量，内标主要包括人源性内标（内源性）和合成假病毒内标（外源性）。内源性内标优于外源性内标，前者可用于监控从样本采集到检测的全过程，后者只能监控抽提和荧光定量检测的步骤。

由于SARS-CoV-2 RNA属于易发生变异的单链RNA，增加检测靶标数量能提高检测准确性。但多种未经修饰的引物和探针在单孔检测体系中会相互干扰，反而会降低扩增效率和检测敏感性。临床实验室应根据检测目的选择检测靶标，联合人源性内标监控从采样到检测的全过程。

2.2 检测方法

在疫情初期，二代测序技术（next generation sequencing，NGS）在病毒的鉴定中发挥了重要作用，凭借NGS技术，仅5 d便获得了病毒全基因组序列[22]，为后续核酸检测试剂盒研发、混合感染鉴别、病毒溯源进化分析、传播模式预测、突变位点发现等奠定了重要基础。多篇基于NGS的文献证实SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒有79.5%的共同序列[23]，发现SARS-CoV-2与蝙蝠相关冠状病毒ZC45和ZXC21的同源性约为88%[24]。尽管NGS具备上述优势，也被列入几个版本的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，但其检测周期长、流程复杂、未标准化、缺乏生物信息分析专业人员、测序深度不足（综合成本和时间）等问题，使其很难成为临床实验室常规开展的检测方法。

实时逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）是目前临床上广泛应用于SARS-CoV-2核酸检测的方法，具有检测时间较短、操作便捷、特异性及重复性更好的特征[25]。我国有多家企业研发了RT-PCR检测试剂盒，目前已有17个基于RT-PCR的检测试剂盒获得审批。2020年3月，全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价报告显示，已获批的试剂对2个弱阳性样本（3.2×103拷贝/mL和640拷贝/mL）的平均检出率分别为87.8%和77.9%[26]。不同检测试剂的检测能力略有差异，因此应尽可能采用不同品牌的检测试剂对疑似样本进行复检，以保证结果的准确性。疫情初期，紧急获批的试剂盒研发时间短，质量良莠不齐，因此临床实验室应在临床应用前完成性能验证，同时在检测过程中做好质量控制，对可疑结果应及时与临床沟通。

由于实验室硬件、软件和人力资源有限，加之检测需求激增，简便、有效的检测技术更受青睐。病毒核酸免抽提法应需而生，但其无法用于检测胍盐灭活样本和混检筛查[27-29]。等温扩增技术在SARS-CoV-2核酸检测中具有良好的应用前景，包括环介导等温扩增[30]、依赖核酸序列扩增[31]、滚环扩增[32]以及一系列由等温扩增技术衍生的方法（如等温扩增联合CRISPRCas13）[33-34]。SARS-CoV-2核酸检测设备也在向小型化、自动化、快速简便的方向发展，基于整合微流控和恒温扩增等技术的集成化的即时检验（point-of-care testing，POCT）产品，实现了分子诊断去中心化，可用于基层疫情防控。然而，等温扩增及其衍生技术和POCT存在灵敏度不足的缺陷，因此仍需不断优化。

3 分析后

《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第七版）》[3]指出，ORF1ab和N基因（或E基因）多个检测通道同时阳性时，可判为阳性，但阴性结果不能排除感染，应考虑各环节中导致假阴性的因素以及检测窗口期。对于单通道阳性结果，不仅要求重新采样进行复检，对结果判定也增加了新的要求，即重新采样检测结果仍为单通道阳性时，可判定核酸检测结果为阳性；检测2种类型样本均得到单靶标阳性结果时，应判定核酸检测结果为阳性。临床上多见N基因单靶标阳性的可能原因有以下几个：（1）试剂盒研发时，2个基因的检测灵敏度存在差异；（2）SARS-CoV-2属于巢病毒目，具有独特的非连续性转录模式，N基因处于3' 端，有更多转录机会；（3）N基因的保守度不及ORF1ab基因，与其他冠状病毒存在交叉反应。

4 混样检测

2020年6月8日，我国国家卫生健康委网站发布的《关于加快推进新冠病毒核酸检测的实施意见》[35]指出，加强核酸检测工作，做到“应检尽检、愿检尽检”，这是“外防输入、内防反弹”的重要措施。医药市场分析报告称，截至2020年年底，我国有将近8亿人次SARS-COV-2核酸检测需求，对应的是超过100亿元人民币的市场规模[36]。面对庞大的检测压力和资源紧缺问题，应探寻有效的解决途径。

混检是血站中筛查献血人员获得性免疫缺陷综合征和丙型肝炎等传染病时常用的一种检测方法，分为混合采集、混合样本和混合模板3种模式。有研究结果显示，SARS-CoV-2感染的发生率＜10%时，混检在理论上可将总体检测能力至少提高69%[37]，但其产生的假阴性结果易造成负面的社会影响[38]。《关于印发新冠病毒核酸筛查稀释混样检测技术指引的通知》[29]规定了其适用范围，规范了样本混合流程，指出了具体的注意事项。《关于印发新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范的通知》[39]规范了混采流程，取消了对检测试剂的方法学限制，提出“选择检测限低和灵敏度高的检测试剂盒”的要求。然而混检仍存在一些问题：（1）无法监控采样质量。获批试剂通过针对人核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）P基因监控样本采集、抽提和扩增全过程。在临床实践过程中，若未检测到该探针信号，则检测结果应被判“无效”，需重新采样或检测，而采取混检方式时，其他样本中的RNase P基因信号会掩盖不合格样本的信号缺如，得到假性“有效”结果。（2）混检样本的复杂性。单个样本或不同患者存在异质性，加之从采样到检测全过程中的人为操作影响，增加了混检样本的复杂性，可能发生优势样本信号掩盖其他混检样本信号，或扩增曲线异常等情况[40]。

鉴于混检具有上述缺陷，建议对于发热门诊有症状患者、密切接触者等高风险人群，直接采用单人份核酸检测；对低风险人群（感染率＜1%）可考虑混检。