林木育种中植物单倍体育种的应用研究

尹燕萍

（山西省林业生态实验基地，山西太原 030031）

在实际林木育种过程中，单倍体育种手段应用广泛，具有较高的育种效果，符合林木发展的具体需求。因此，需在明确单倍体植物产生途径的基础上，把握单倍体育种的影响因素，解决以往单倍体育种存在的问题，确保该技术能有效应用至实际林木育种工作中，促进林业经济的可持续协调发展。

1 单倍体植物的产生途径

单倍体植物最早由Dorothy Bergner 于1921 年在曼陀罗自然群体中发现，起源于植物单性生殖，性状多表现为母本，且偶发性较低，并不适用于早期的育种工作。在此基础上，单倍体育种手段的研究最早开始于20世纪，而在长期研究过程中，已经形成花药离体培养为主的单倍体育种技术体系，虽然未能解决单倍体获取的偶然性问题，但诱导频率显著提高，具备了应用至林木育种工作中的可行性。

1.1 孤雌生殖

孤雌生殖技术诞生于20 世纪50 年代末期，是指基于离体培养未受精子房或胚珠诱发卵细胞单性发育的一种育种手段，从目前来看，可应用该技术实现杨树、橡胶、刺槐等林木的单倍体育种，育种效果较好。但在长期实践中发现，孤雌生殖技术的弊端在于无法解决雌核发育起源的稳定性问题，即胚囊发育不会跟随离体条件的变化而变化，导致子房单倍体诱导存在较大限制，因此，多作为补充技术辅助花药离体培养手段。

1.2 孤雄生殖

针对花药或花粉进行离体培养获取单倍体植物，这是孤雄生殖育种方法的基本原理，其中，以花粉为依托进行细胞再生培养，即所有再生植株均产生于花药中的花粉，往往具有较大的操作难度，因此，直接借助花药开展再生植株器官培养，既可将花粉作为再生植株的育种源头，又可将体细胞组织作为再生植株的育种源头，整体操作难度显著降低，成功率较高，是一种应用较为广泛且符合实际林木育种需求的单倍体诱导手段。

2 影响单倍体育种花药培养的主要因素

以孤雄生殖手段为主导的花药离体培养本质是依托内外因配合作用避免花粉粒由原本的配子体发展途径转化为孢子体发展途径，而这往往是单倍体植株育种的关键所在。其中，从内因角度来看，影响单倍体育种过程花药离体培养的因素一般包括植株基因、植株生理状况、小孢子发育等；从外因角度看，包括预处理手段、培养基选择、培养环境提供在内的诸多因素均可能影响单倍体育种花药离体培养的质量。

2.1 内因

2.1.1 基因型。在花药离体培养过程中，单倍体育种的整体质量往往决定于植株的基因型，即在离体培养过程中，不同基因类型植株表现出的愈伤组织诱导率、分化率、胚状体诱导率和植株诱导率均存在较大差异。在此基础上，借助长期试验，发现茄科、禾本科、十字花科花药进行离体培养的成功率相对较高，而豆科植物花药则在离体培养中反应性较低，这从侧面印证了花药离体培养技术的局限性。此外，植株细胞质的不同也会在很大程度上影响离体培养的实际质量。

2.1.2 供体植株生理状况。考虑到花药离体培养需建立在具备高质量供体植株基础上，因此，供体植物的生理性状同样会在一定程度上影响花药离体培养的结果，其中，当采用盛花期的花药时，雄核发育率相对较高，当采用幼年植株的花药时，花药的离体培养反应性较强。此外，花药离体培养还受供体植株的生长环境限制，当供体植株所处环境季节变化及水分情况不同时，花药离体培养的成果也会发生较大变化，究其原因，多与小孢子发育受营养供给和内源激素影响有关。

2.1.3 小孢子发育。在植株进入小孢子发育阶段后，采取恰当的预处理手段往往会导致小孢子呈现不同于自然状态的生长性状，尤其是小孢子配子体发育途径优化为孢子体发展途径，但从实际看，不同植株所适用的预处理时间往往不同，对大多数林木来说，一般可在单核靠边期进行处理，达到最佳的育种效果。

2.2 外因

2.2.1 预处理。在花药预处理过程中，包括饥饿、热激、高渗透胁迫、化学处理在内的处理方法均十分常见，采用何种处理方式往往取决于植株的基因型。在此基础上，不同的预处理手段给植株花药带来的影响效果往往不同，最终使单倍体育种呈现出不同的结果。

2.2.2 培养基。在花药离体培养过程中，基本培养基、植物生长调节剂、附加物质、碳源共同组成了花药的培养环境，以植物生长调节剂为例，大部分植物花药对生长调节剂的依赖性均相对较高，而在通常情况下，可采用2，4-D 和IAA 生长素支撑花药的离体培养。此外，林木植物花药培养过程中，培养基中要含有生长素和细胞分裂素，是保障花药脱分化和再分化成功率的关键。

2.2.3 培养环境。在花药离体培养过程中，培养环境与花药生长需求的匹配性往往会显著影响离体培养的效率和质量。培养环境通常可分为室内温度和光照强度，不同植株花药对温度和光照的需求存在差异。

3 林木育种中花药培养育种的应用现状

在单倍体育种领域，最早以花药为依托获取单倍体是1964 年印度Guha 的毛曼陀罗试验，在林木育种领域，最早开始于1974 年的培养杨树试验，在此基础上，经长期发展，当前花药培养获取单倍体的技术理论已相对成熟，具备了在林木育种中导入的可行性和实效性。但由于林木生殖周期较长，供体植株会处于长期变化的气温与降水环境中，导致花药的离体培养效果与预期差距较大，影响了相关试验的顺利开展。目前，已能借助花药离体培养手段获取单倍体的林木种类包括辽杨、黑杨、茶树等。

4 林木育种中花药培养育种存在的问题

4.1 花药培养基因型依赖性较高

花药离体培养的成果很大程度上取决于供体植株的基因型，这意味着培养过程无法打破不良基因的连锁效应，基因重组的可行性相对较低。试验发现，大部分木本植物均属于顽固型基因型，只有少数可通过花药离体培养获取单倍体。同时，大多数林木生长周期长、影响因素多，难以保障花药取材的质量，最终影响花药离体培养的成功率。

4.2 花药培养再生植株倍性混乱、来源不清

在花药愈伤组织诱导分化时，由于多倍体植株来源不清，导致诱导分化的难度较大，对试验人员的能力要求较高。同时，花药离体培养属于器官培养范畴，花药培养过程除了会导致小孢子的发育，还会伴随体细胞组织的生长，因此，如何抑制体细胞生长且不影响小孢子雄核发育速率，以及如何有效确保单倍体植株的成功获取，是林木花药离体培养试验中所面临的主要问题。

4.3 林木花药培养机制处于起步研究阶段

目前与农作物相比，林木花药离体培养的特殊性较高，且由于林木生长周期较长，导致林木花药培养的成功率普遍较低，在农业领域，林木花药离体培养的理论研究相对较少，缺乏对林木花药离体培养机理的深入认识，严重影响了实际离体培养试验的成功率，也限制了花药离体培养获取单倍体育种手段的全面推广。

5 林木育种中花药培养育种的发展策略

5.1 借助基因改良手段提高花药离体培养的成功率

印度植物学家提出选择高频率再生基因型植株开展花药离体培养试验的理论，应合理选择植株的基因型，在确保花药离体培养可行性的基础上，保障单倍体获取的成功率。同时，应针对花药培养反应较差的基因型选择杂交育种手段，可显著提高雄核的发育效率，在此基础上，可结合γ-射线照射手段提高花药的反应性，最终为林业育种提供可借鉴的手段。

5.2 优化培养方式以减少体细胞干扰

针对花药离体培养过程小孢子发育容易受体细胞影响的问题，可借助固、液双层培养基处理花药，使花药正常开裂，不产生愈伤组织，最终既避免了体细胞的干扰，又不会因采用机械游离手段破坏小孢子的生理结构。此外，应针对不同植株花药培养需求设计不同的培养基环境，在确保营养供给充足的基础上，保障小孢子雄核的发育质量。

5.3 加强林木花药培养机理

在现阶段花药离体培养过程中，再生植株倍性混乱十分常见，因此，应加强林木花药培养机理的理论研究，在创新应用现代分子生物学手段的过程中，拓宽单倍体植株的花药获取途径，清楚把握不同林木植株所适用的培养方法和培养环境，最终在借鉴农作物育种手段的基础上，促进林木育种工作的创新发展。

6 结语

综上所述，在现代科学技术不断发展过程中，林木育种的手段更加多样，更加有效，以花药离体培养为支撑的单倍体育种关键在于针对不同的林木植株选择恰当的花药离体培养方式和培养环境。因此，应深入研究当前国内外林木花药离体培养领域存在的不足，在探索全新花药离体培养途径的基础上促进林木育种水平的显著提高，最终推动我国林业经济的可持续创新发展。