桔梗多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响

王菊，梁蕾

(1. 长春医学高等专科学校 基础护理教研室，长春 130031；2. 长春市传染病医院 药剂科，长春 130123)

桔梗始载于《神农本草经》，为药食同源类中药，具有抑炎、镇咳、祛痰等药理作用，三萜皂苷类、甾醇类、酚类、黄酮类及多糖类是其主要功效成分[1]。近年来，桔梗多糖的生物活性逐渐引起了人们的注意，它具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、保肝及抗感染等作用[2]。研究发现，桔梗多糖可显著抑制HeLa细胞增殖[3]，也可通过调节细胞凋亡相关基因的表达促进肿瘤细胞的凋亡而发挥抑制小鼠子宫颈癌细胞U14生长的作用[4]。但桔梗多糖对S180恶性肉瘤细胞的作用未见报道，同时，鉴于免疫功能调节是中药抗肿瘤的重要机制[5]，本研究以S180荷瘤小鼠模型为研究对象，在进一步探讨桔梗多糖是否具有抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长作用的过程中重点关注其对机体免疫功能的影响，以期为桔梗多糖的临床应用奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象S180瘤株及小鼠淋巴瘤YAC-1细胞，购自上海歌凡生物科技有限公司。C57BL/6小鼠，55只，SPF级，雄性，体质量(20±2) g，6～8周龄，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.2 药物与试剂桔梗多糖粉末，购自上海融禾医药科技发展有限公司，多糖含量>80.0%；环磷酰胺注射液，购自江苏恒瑞医药股份有限公司；FBS及RPMI 1640培养液，购自HyClone公司；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)及MTT溶液，购自Sigma-Aldrich公司；EZ-SepTMMouse 1×淋巴细胞分离液，购自南京建成生物工程研究所；小鼠血清IL-2及IFN-γ检测试剂盒，购自北京达科为生物技术有限公司；兔抗小鼠TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)及NF-κB多克隆抗体，购自CST公司；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗体及山羊抗兔IgG-HRP二抗，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验仪器BHC-1300ⅡA2生物安全柜，来自上海鼎科科学仪器有限公司；BPH-9042精密恒温培养箱，来自上海一恒科学仪器有限公司；JA5103N电子天平，来自上海力辰仪器科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶标仪，来自Thermo Fisher Scientific公司；Mini-PROTEAN Tetra电泳槽，来自伯乐公司。

1.4 小鼠S180肿瘤模型的建立用无菌生理盐水稀释培养至对数生长期的S180细胞至2×106个/mL密度，制备S180细胞悬液。随机取5只健康C57BL/6小鼠，分别腹腔注射0.4 mL上述细胞悬液。1周后，可见小鼠腹部明显凸起、涨大，颈椎脱臼处死小鼠，并在无菌条件下抽取腹水。于显微镜下计数腹水细胞，无菌生理盐水调整细胞密度至1×106个/mL，另随机取40只健康小鼠,分别于右腋皮下处注射上述腹水悬液0.2 mL，制备S180荷瘤小鼠模型。

1.5 分组、给药及抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数的测定将荷癌小鼠随机分为模型对照组、环磷酰胺(0.02 g/kg)组及桔梗多糖低(0.2 g/kg)、高(0.4 g/kg)剂量组，每组10只；另取10只健康小鼠作为空白对照组。桔梗多糖的给药剂量参考陆文总等[4]的研究并结合预实验结果确定。环磷酰胺组腹腔注射给药，桔梗多糖低、高剂量组灌胃给药，1次/d，连续治疗14 d。末次给药后24 h，取小鼠球后静脉丛血液，离心、分离血清；颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下剥离瘤块，电子天平称重；摘取小鼠的胸腺及脾脏，称重后计算抑瘤率、胸腺指数及脾脏指数。

抑瘤率=(模型对照组瘤质量-药物处理组瘤质量)/模型对照组瘤质量×100%

胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)质量/体质量×100%

1.6 H-E染色观察瘤组织病理形态用4%多聚甲醛固定新鲜肿瘤组织样本，经75%乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋等步骤后，将组织块切成4 μm厚度的薄片；分别用苏木精及伊红染色处理，经中性树脂封片后于光学显微镜下观察并摄片。

1.7 淋巴细胞增殖刺激指数的测定参考文献[6]处死小鼠后，无菌条件下剖取脾脏，PBS漂洗2次；将脾脏置于RPMI 1640培养液中，用注射器拉杆柄轻轻研磨，经200目滤网过滤。收集滤液于1.5 mL无菌离心管中，1 700×g离心5 min；将沉淀溶于Tris-NH4Cl溶液中，用红细胞裂解液去除红细胞；1 700×g离心5 min收集沉淀；将沉淀溶于RPMI 1640完全培养液中。台盼蓝染色计数淋巴细胞，调整脾脏淋巴细胞悬液至密度为5×106个/mL。于96孔细胞培养板中先分别加入100 μL脾脏淋巴细胞悬液，再分别加入100 μL ConA(10 μg/mL)，于5% CO2、37 ℃条件下培养48 h， 此为实验组； 阴性对照组不加ConA， 其余操作同实验组。参考文献[7]，通过MTT法检测各孔光密度[D(570 nm)]值，计算淋巴细胞增殖刺激指数(公式如下)。

淋巴细胞增殖刺激指数=实验组D(570 nm)值/对照组D(570 nm)值

1.8 NK细胞活度的测定调整处于对数生长期的YAC-1细胞(靶细胞)密度至1×105个/mL；调整制备的脾脏淋巴细胞(效应细胞，含NK细胞)密度至2×106个/mL。各取100 μL效应细胞、靶细胞悬液至96孔细胞培养板，于5% CO2、37 ℃条件下培养72 h，此为实验组； 另设靶细胞组(培养液和靶细胞悬液各100 μL)和效应细胞组(培养液和效应细胞悬液各100 μL)，其余操作同实验组。MTT法检测各孔D(570 nm)值，计算NK细胞活度(公式如下)。

NK细胞活度={1-[实验组D(570 nm)值/靶细胞组D(570 nm)值-效应细胞组D(570 nm)值/靶细胞组D(570 nm)值]}×100%

1.9 小鼠血清细胞因子水平的测定ELISA检测各组小鼠血清IL-2及IFN-γ水平，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.10 小鼠瘤组织炎症相关蛋白表达水平的测定于冰水浴条件下的研钵中研磨肿瘤组织，加入组织裂解液充分裂解，制备总蛋白提取液。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定总蛋白含量，煮沸变性后加入上样缓冲液。进行12% SDS-PAGE及半干法转膜，加入相应的兔抗小鼠TLR4(1∶2 000)、MyD88(1∶1 000)及NF-κB(1∶1 000)多克隆抗体，于4 ℃条件下孵育12 h。依次经TBST洗膜，山羊抗兔IgG-HRP孵育，显影及曝光后，通过Quantity One软件分析各目的条带的灰度值。

2 结果

2.1 桔梗多糖抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长与空白对照组比较，给药7 d后，环磷酰胺组小鼠体质量显著降低(P<0.05)；给药14 d后，与空白对照组比较，环磷酰胺组及模型对照组小鼠体质量显著降低(均P<0.05)；给药7 d及14 d后，与空白对照组比较，桔梗多糖低、高剂量组小鼠体质量无显著变化(均P>0.05)。与模型对照组比较，给药7 d及14 d后，环磷酰胺组小鼠体质量降低，而桔梗多糖低、高剂量组小鼠体质量增加，但差异不显著(均P>0.05)。与模型对照组比较，环磷酰胺组及桔梗多糖低、高剂量组小鼠瘤质量显著减少(均P<0.05)，抑瘤率显著增加(均P<0.05)。H-E染色结果可见，模型对照组小鼠肿瘤细胞排列紧密，核固缩、核碎裂少见；环磷酰胺组小鼠肿瘤细胞排列松散，大部分细胞呈现核固缩、核碎裂等改变；桔梗多糖低、高剂量组小鼠肿瘤细胞排列较紧密，部分细胞出现核固缩、核碎裂等改变。(图1)

注：A. 各组小鼠体质量的变化曲线；B. 各组小鼠肿瘤质量的统计分析结果；C. 各组小鼠肿瘤标本的比较； D. 各组荷瘤小鼠抑瘤率的统计分析结果；E. 各组荷瘤小鼠肿瘤组织的H-E染色结果(×200)。Ⅰ为空白对照组；Ⅱ为模型对照组；Ⅲ为环磷酰胺组；Ⅳ为桔梗多糖低剂量组；Ⅴ为桔梗多糖高剂量组。与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05。图1 桔梗多糖对各组小鼠及移植瘤一般情况的影响〗

2.2 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠胸腺指数及脾脏指数胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，本研究发现，与空白对照组比较，模型对照组、环磷酰胺组及桔梗多糖低、高剂量组小鼠的胸腺指数及脾脏指数均降低，差异有统计学意义(均P<0.05)；与模型对照组比较，环磷酰胺组小鼠胸腺指数及脾脏指数显著降低(均P<0.05)，而桔梗多糖低、高剂量组小鼠相应指数显著增加(均P<0.05)。以上结果提示，桔梗多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用与其促进小鼠免疫功能有关。(表1)

表1 桔梗多糖对各组小鼠胸腺指数及脾脏指数的影响

2.3 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠淋巴细胞增殖刺激指数及NK细胞活度与空白对照组比较，模型对照组、环磷酰胺组小鼠淋巴细胞增殖刺激指数及NK细胞活度显著降低(均P<0.05)，桔梗多糖低剂量组的NK细胞活度与之相比也显著降低(P<0.05)。与模型对照组比较，环磷酰胺组小鼠淋巴细胞增殖刺激指数显著降低(P<0.05)，而NK细胞活度变化无显著差异(P>0.05)；与模型对照组比较，桔梗多糖低、高剂量组小鼠淋巴细胞增殖刺激指数及NK细胞活度显著增加(均P<0.05)。以上结果进一步提示，桔梗多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用与其促进机体免疫功能有关。(表2)

表2 桔梗多糖对各组小鼠淋巴细胞增殖刺激指数及NK细胞活度的影响

2.4 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠血清IL-2及IFN-γ水平与空白对照组比较，模型对照组、环磷酰胺组小鼠血清IL-2及IFN-γ水平显著降低(均P<0.05)，桔梗多糖低、高剂量组小鼠IL-2水平变化无显著差异(均P>0.05)，而IFN-γ水平显著降低(均P<0.05)。与模型对照组比较，环磷酰胺组IL-2水平显著降低(P<0.05)，IFN-γ水平显著增加(P<0.05)；给予低、高剂量的桔梗多糖治疗后，IL-2及IFN-γ水平显著增加(均P<0.05)。上述结果表明，增加荷瘤小鼠血清细胞因子表达是桔梗多糖抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长的可能机制之一。(表3)

表3 桔梗多糖对各组小鼠血清IL-2及IFN-γ水平的影响

2.5 桔梗多糖下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活性与模型对照组比较，环磷酰胺组及桔梗多糖低、高剂量组TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达量显著降低(均P<0.05)。上述结果表明，桔梗多糖具有抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路活化的作用。(图2、表4)

注：Ⅱ为模型对照组；Ⅲ为环磷酰胺组；Ⅳ为桔梗多糖低剂量组；Ⅴ为桔梗多糖高剂量组。图2 桔梗多糖对各组小鼠瘤组织TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达的影响

表4 桔梗多糖对各组小鼠瘤组织TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达的量化影响

3 讨论

机体免疫系统与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。近年来，免疫类中药多糖因其抗肿瘤活性显著、毒副作用小且具有调节机体免疫功能等特点被广泛应用于临床[8]。胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所，对维持淋巴器官发育及机体免疫功能的正常发挥作用关键，胸腺若退化机体的免疫功能也会降低[9]。脾脏是机体体液免疫和细胞免疫的“生发”中心，为机体最大的外周淋巴组织器官，通过输出巨噬细胞、淋巴细胞等调节免疫功能[10]。本研究发现，与模型对照组比较，桔梗多糖低、高剂量组小鼠胸腺指数及脾脏指数均明显增加，提示桔梗多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用与增加其免疫功能有关。此外，桔梗多糖低、高剂量组小鼠淋巴细胞增殖刺激指数及NK细胞活度均明显增加，进一步提示桔梗多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用与其免疫功能的增加有关。

细胞因子表达水平是衡量机体免疫功能的重要指标，可间接反映机体的免疫功能和肿瘤的进展情况[11]。IL-2由活化的T细胞产生，具有强大的抗肿瘤效应，为最强的免疫活性细胞调节因子，被认为是免疫系统产生抗肿瘤作用的首要因素[12]。IFN-γ由T细胞和NK细胞产生，是1种免疫调节剂，可增强NK细胞的活性，也可促进CTL杀伤肿瘤细胞的敏感性[13]。本研究结果发现，与模型对照组比较，桔梗多糖低、高剂量组小鼠IL-2及IFN-γ水平均明显增加，表明增加荷瘤小鼠血清细胞因子的表达是其抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长的可能机制之一。

研究表明，TLR信号通路与许多中药多糖的免疫调节作用有关，其中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在中药多糖主导的抗肿瘤及免疫调节等过程中发挥关键作用[14-15]。MyD88是1种细胞内信号转导衔接蛋白，含TLR的胞内结构域，TLR4可通过与MyD88结合促进NF-κB活化，诱导肿瘤的发生发展[16-17]。研究发现，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活化，进而改善机体免疫功能是多种中药成分发挥抗肿瘤作用的主要机制[18-19]。本研究结果同样发现，与模型对照组比较，桔梗多糖低、高剂量组小鼠TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达均明显降低，表明阻断该信号通路的活化与其抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长关系密切。

综上所述，本研究证实桔梗多糖具有抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长的作用，该作用与改善机体免疫功能有关，但具体的作用机制还有待于进一步研究。