马齿苋总黄酮改善小鼠非酒精性脂肪肝的作用

姚瑞强，宋维芳，胡鑫丽，张文慧

(山西医科大学汾阳学院，汾阳 032200)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由除酒精以外的其他明确的损伤肝脏因素导致的，以弥漫性肝细胞脂肪变性和肝细胞内三酰甘油(triglyceride，TG)蓄积过多为显著特征的临床病理综合征[1]。化学药物对NAFLD的治疗作用有限，大多数降脂药可导致肝细胞损伤[2]。因此，寻找有效治疗NAFLD的药物并研究其机制非常必要。马齿苋是一年生肉质草本药食同源植物[3]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、增强免疫力等多种作用[4-7]。马齿苋含有黄酮类、生物碱类和萜类等多种化学成分[8-9]，其中黄酮类化合物具有丰富的药理作用，在抑菌和抗肿瘤方面的研究报道较多[10]。本研究的考察重点是马齿苋总黄酮(portulaca oleracea total flavones，POTF)对NAFLD小鼠脂质代谢、氧化应激及炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 小鼠NAFLD模型的构建及分组4～6周龄SPF级雄性昆明小鼠40只，购买并喂养于山西医科大学动物实验中心，体质量17～22 g，适应性喂养1周后随机分为5组(每组8只)：对照组、NAFLD组、POTF 2.5 mg/kg组、POTF 5 mg/kg组、POTF 10 mg/kg组。对照组给予标准饲料喂养，其他4组每天给予高脂饲料喂养，同时POTF 2.5 mg/kg组、5 mg/kg组、10 mg/kg组小鼠分别以溶解于0.5 mL的2.5、5、10 mg/kg POTF灌服，对照组和NAFLD组小鼠灌服等容量0.9%氯化钠溶液，每天1次，连续4周。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 在给药第4周末使小鼠禁食水10 h，次日麻醉，剖腹分离并暴露腹主动脉，取血0.5 mL，4 ℃静置24 h，以1 000 ×g离心10 min分离上层血清，分装，待测或-20 ℃保存。采用脱颈椎处死法处死小鼠，立即摘取其肝脏，用滤纸吸干血液。取肝左外侧叶置4%多聚甲醛中固定，待H-E染色。另取肝右外侧叶1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小立即冰冻切片，自然晾干后待红油O染色。然后，取肝脏组织约200 mg放入冻存管，置冰盒中-80 ℃保存。

1.3.2 血清生化指标和空腹血糖的测定 取上述“1.3.1”项采集的血清进行检测。使用HITACHI 7600型全自动生化分析仪，采用连续检测法测定丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)，采用酶法测定TG，采用己糖激酶法测定空腹血糖。

1.3.3肝损伤的H-E染色观察 用二甲苯脱蜡组织切片，进行2次，每次10 min。依次在100%、90%、80%、70%乙醇中各浸泡3 min。用苏木精染色2 min，1%盐酸乙醇分化10 s，稀氨水返蓝20 s，伊红染色3 min。以上每个步骤处理后均用去离子水冲洗3次，每次各1 min。再依次经过70%、80%、90%、100%乙醇脱水，每个梯度各5 min。二甲苯透明2次，每次10 min，之后用中性树脂封片。在显微镜下观察染色结果并拍照。

1.3.4 脂质堆积的油红O染色观察 用PBS洗涤切片3次，4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗涤3次，60%异丙醇润洗10 s，加入0.3%油红O染色液染色1 min，再经60%异丙醇漂洗及PBS漂洗3次，在显微镜下观察并拍照。

1.3.5 脂代谢标志物的Western blotting检测 取上述“1.3.1”项储存的组织约100 mg，采用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。用10% SDS-PAGE分离组织中的蛋白，并转移到PVDF膜上。用5%BSA封闭后，用一抗(CPT-1、ACC)在4 ℃孵育过夜。然后将膜与二抗在室温下孵育45 min。最后，用ECL检测试剂盒检测条带。信号通过Image Lab v 3.0软件进行分析。

1.3.6 氧化应激相关分子的试剂盒检测 取上述“1.3.1”项保存的血清进行检测。采用可见分光光度法检测SOD活性及MDA、GSH水平，根据试剂盒使用说明进行操作。

1.3.7 肝组织中IL-6和IL-10水平的ELISA检测 采用ELISA试剂盒检测IL-6和IL-10的水平，根据试剂盒说明书进行操作。按照组织质量(g)∶提取液体积(mL)为1∶5～1∶10的比例(建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液)进行冰浴匀浆；以8 000 ×g4 ℃离心10 min，取上清液，置冰上待测。向包被微孔中依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。在所有孔中加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，最后加入终止液50 μL。使用多功能酶标仪(Multiskan Sky，Thermo Fisher公司)检测光密度[D(450 nm)]值。

2 结果

2.1 POTF对NAFLD小鼠血清生化指标和空腹血糖的影响与对照组比较，NAFLD组的ALT、AST、TG和空腹血糖水平显著升高(P<0.05)。与NAFLD组比较，POTF 2.5 mg/kg组、5 mg/kg组和10 mg/kg组的ALT、AST、TG和空腹血糖水平呈现剂量依赖性降低，且POTF 5 mg/kg组和10 mg/kg组的ALT、AST、TG和空腹血糖水平降低更显著(P<0.05)。详见表1。

表1 各组血清生化指标和空腹血糖水平的比较

2.2 POTF对NAFLD小鼠肝损伤的影响大体上，对照组小鼠肝脏未见异常；NAFLD组肝脏体积增大，质地变硬，局部有一定的变黄和质地油腻；POTF组较NAFLD组的异常有不同程度的减轻。对照组小鼠肝组织细胞结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状分布；NAFLD组小鼠肝组织细胞中央静脉不规则，细胞排列不均匀，结构被破坏，出现明显的细胞坏死。与NAFLD组比较，POTF组小鼠肝组织细胞的坏死情况均得到减轻，且随着POTF剂量的增加，减轻效果更加显著，POTF 10 mg/kg组接近对照组。由此可见，POTF可以改善NAFLD小鼠的肝损伤。详见图1。

图1 小鼠肝损伤的H-E染色(×200)

2.3 POTF对NAFLD小鼠脂质堆积的影响油红O染色结果显示，与对照组比较，NAFLD组小鼠肝组织细胞中有大量的红色脂滴聚集；与NAFLD组比较，POTF组的脂滴聚集逐渐减少，且随着POTF剂量增加效果更明显，POTF 10 mg/kg组接近对照组。由此可见，POTF可以减缓NAFLD小鼠的脂质堆积。详见图2。

图2 小鼠脂肪堆积的油红O染色(×200)

2.4 POTF对NAFLD小鼠脂肪代谢的影响Western blotting检测脂肪合成代谢相关指标ACC和脂肪分解代谢相关指标CPT-1的表达。结果显示，与对照组(CPT-1 0.140±0.020，ACC 0.010±0.006)比较，NAFLD组的CPT-1的表达量(0.010±0.005)显著下调(P<0.05)，而ACC的表达量(0.720±0.050)显著上调(P<0.05)。与NAFLD组比较，POTF 5 mg/kg组和10 mg/kg组CPT-1表达量(0.090±0.030，0.180±0.035)显著上调(P<0.05)，而ACC表达量(0.080±0.045，0.020±0.010)显著下调(P<0.05)。这提示，POTF可以促进NAFLD小鼠的脂肪分解代谢，并抑制NAFLD小鼠的脂肪合成代谢。详见图3。

注：A. Western blotting检测CPT-1和ACC蛋白的表达；B. 各组CPT-1和ACC表达量的比较。与对照组比较，*P<0.05；与NAFLD组比较，#P<0.05。图3 Western blotting检测ACC和CPT-1的蛋白表达水平

2.5 POTF对NAFLD小鼠SOD活性及MDA、GSH水平的影响与对照组比较，NAFLD组的SOD活性和GSH水平显著降低(P<0.05)，而MDA水平显著升高(P<0.05)。与NAFLD组比较，POTF 5 mg/kg组和10 mg/kg组SOD活性和GSH水平显著升高(P<0.05)，而MDA水平显著降低(P<0.05)。由此可见，POTF可以改善NAFLD小鼠的氧化应激。详见表2。

表2 各组SOD活性及MDA、GSH水平的比较

2.6 POTF对NAFLD小鼠肝组织中IL-6和IL-10水平的影响ELISA检测肝组织中促炎因子IL-6和抗炎因子IL-10水平。结果显示，与对照组[IL-6(16±9)pg/mL，IL-10(29±4)pg/mL]比较，NAFLD组IL-6水平[(114±15)pg/mL]显著升高(P<0.05)，而IL-10水平[(4±2)pg/mL]显著降低(P<0.05)。与NAFLD组比较， POTF 5 mg/kg组和10 mg/kg组IL-6水平[(64±15)pg/mL，(37±11)pg/mL]显著降低(P<0.05)，而IL-10水平[(13±6)pg/mL，(27±5)pg/mL]显著升高(P<0.05)。由此可见，POTF可以改善NAFLD小鼠的炎症反应。详见图4。

注：A. 各组IL-6水平的比较；B. 各组IL-10水平的比较。与对照组比较，*P<0.05；与NAFLD组比较，#P<0.05。图4 ELISA测定IL-6和IL-10的水平

2.7 POTF对NAFLD小鼠肝组织中NF-κB p65表达的影响IHC检测了与炎症相关的NF-κB p65在肝组织中的表达情况。与对照组[(2±2)%]比较，NAFLD组NF-κB p65相对表达量[(46±4)%]显著增加(P<0.05)；与NAFLD组比较， POTF 5 mg/kg组和10 mg/kg组NF-κB p65 相对表达量[(23±6)%，(14±5)%]显著降低(P<0.05)。由此进一步证实，POTF可以通过抑制NF-κB p65的表达缓解炎症反应。详见图5。

注：A. 在显微镜下观察小鼠肝组织中NF-κB p65相对表达(×200)；B. 各组NF-κB p65相对表达量的比较。与对照组比较，*P<0.05；与NAFLD组比较，#P<0.05。图5 IHC检测小鼠肝组织中NF-κB p65的表达

3 讨论

马齿苋是药食同源的中药材，在不同体系中均表现出对肝损伤的治疗作用[12]，其作用机制包括减轻炎症、氧化应激、凋亡和改善脂质代谢等[13]。本研究发现，POTF可明显改善NAFLD小鼠肝组织损伤和脂质堆积情况，POTF组ALT、AST、TG、空腹血糖、ACC、IL-6、MDA及NF-κB p65水平相较于NAFLD组显著降低，而CPT-1水平、GSH水平、SOD活性及IL-10水平显著升高。这提示，POTF可能通过减轻脂质代谢异常、氧化应激和炎症反应改善高脂饮食昆明小鼠的NAFLD。

NAFLD的主要病理特征之一是以肝细胞内TG积蓄为主的代谢紊乱，且肝细胞受损。胰岛素抵抗是NAFLD的重要危险因素。有研究发现，如果存在肝细胞脂肪的大量积累与系统性肝胰岛素抵抗，就会致使肝脏抗脂质毒性保护和脂肪组织产生自由基之间的不平衡，进而导致炎症反应、内质网应激、氧化应激和肝细胞凋亡等[14-16]。有研究发现，肝受损后，生化指标ALT、AST、TG水平出现异常[17]。马齿苋可提高四氧嘧啶糖尿病小鼠血清胰岛素水平，降低小鼠空腹血糖，并具有较强的调脂作用[4]。也有荟萃分析显示，马齿苋可能具有改善血脂和血糖水平的作用[18]。上述研究与本研究结果相一致。本研究发现，NAFLD小鼠的ALT、AST、TG和空腹血糖都异常升高，H-E和油红O染色也证实NAFLD小鼠发生了肝组织损伤且脂质堆积严重。而经过一定剂量的POTF给药后，上述症状得到明显缓解，显然POTF在NAFLD小鼠中具有降血脂和血糖的功效。本研究脂肪代谢标志物CPT-1和ACC的蛋白表达结果进一步说明，POTF可通过上调脂肪分解代谢指标CPT-1同时下调脂肪合成代谢指标ACC对脂质代谢起调控作用。

固有免疫激活相关的炎症反应在NAFLD的诱发和加重中起重要作用[19]。来自脂肪组织的炎症信号、肠道微生物的产物和肝炎导致的受伤或垂死载脂肝细胞信号均能激活肝脏内免疫细胞的固有免疫，诱发和加重肝炎，导致NAFLD进展。研究发现，对固有免疫和炎症的调控机制可能是二甲双胍等对NAFLD的作用[20]。抑制炎症可能是阻止NAFLD恶性进展的有效手段，而马齿苋具有典型的抗炎和免疫调节作用[21]。本研究发现，在高脂饮食的小鼠中，POTF能降低IL-6水平，增加IL-10水平，表明其抑制NAFLD可能与炎症抑制有关。

炎症和脂肪变性可诱导内质网应激、氧化应激、细胞凋亡和坏死等一系列恶性变化，进而导致肝纤维化和肝硬化进展[22]。这些因素往往在免疫系统作用下相互促进[23]。NAFLD自身造成的代谢综合征以及在患者基因突变等综合因素影响下，肝病可进一步进展甚至导致肝癌[24]。有研究发现，马齿苋提取物对LPS诱导的大鼠肺损伤有抗炎、抗氧化作用[6]。还有研究证实，POTF可通过下调大鼠肝纤维化细胞TGF-β1基因及蛋白表达有效治疗肝细胞纤维化病变，预防肝癌及肝硬化[25]。在大鼠急性酒精性脂肪肝病模型中，POTF能有效改善炎症、氧化应激和脂质代谢，进而减轻大鼠的急性酒精性脂肪肝病[13]。本研究对氧化应激相关分子SOD、MDA和GSH的检测结果显示，POTF可逆转氧化应激造成的SOD和GSH水平下降，并消除脂质过氧化产物MDA的积累。POTF也可减少NAFLD小鼠的促炎因子IL-6水平，并刺激抗炎因子IL-10高表达。这些结果均提示，POTF可明显改善NAFLD小鼠的氧化应激和炎症反应。用IHC进一步检测与炎性因子合成相关的NF-κB p65在组织中的表达情况，结果显示POTF可减轻氧化应激，下调NAFLD小鼠NF-κB p65的高表达，进而抑制肝脏损伤。

综上所述，POTF可通过调节脂质代谢异常、缓解氧化应激和抑制炎症反应来改善NAFLD小鼠的肝损伤。本研究为POTF作为治疗NAFLD的潜在、有效的药物提供了基础证据。