串联质谱联合高效液相色谱应用于新生儿甲基丙二酸血症中的效果研究

邓雯，周鑫，袁幼红

（宜昌市妇幼保健院检验科，湖北 宜昌443100）

甲基丙二酸血症（MMA）是我国最常见的器质性酸尿症，发病年龄不同，多为新生儿，其临床表现非常复杂，且缺乏特异性，易导致误诊或漏诊，具有较高的致残率和死亡率，如治疗不及时会给脏器造成不可逆的损伤，因此，早期诊断和治疗尤为重要[1]。长期以来，MMA的早期筛选主要依靠串联质谱法检测血样中丙酰基肉碱（C3）和乙酰基肉碱（C2），并计算其比值，具有检测迅速、创伤小、灵敏度高、特异性强等特点[2]。然而，串联质谱筛查中最突出的问题是阳性预测值低、初筛阳性率高并具有漏检现象。因C3等指标易受出生胎龄、体质量、低血糖、感染、抗生素使用等因素干扰，或处于临界值或稍有升高，会出现假阳性状况，反之，由于部分新生儿出生后72 h内缺乏蛋白质，处于疾病窗口期，C3等指标会显示正常，出现假阴性，导致漏检，因此，探寻其他有效筛查方式具有重要意义[3-4]。本研究在串联质谱检测的基础上联合高效液相色谱检测，分析血片中C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平变化情况，旨在为新生儿MMA患儿的筛查提供实验依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2018年10月至2019年10月本院收治的55例新生儿MMA患儿作为研究组，另选取同期55名健康新生儿作为对照组。对照组男26例，女29例；胎龄38～42周，平均胎龄（40.24±1.27）周；日龄1～25 d，平均日龄（10.28±1.27）d；出生体质量1～4 kg，平均体质量（2.46±0.51）kg。研究组男25例，女30例；胎龄38～42周，平均胎龄（40.45±1.11）周；日龄1～24 d，平均日龄（10.39±1.40）d；出生体质量2～4 kg，平均体质量（2.54±0.37）kg。两组临床资料比较差异无统计学意义，具有可比性。所有患儿家属均对本研究知情同意并自愿签署知情同意书。本研究已通过本院伦理委员会审核批准。纳入标准：符合《儿科学（第9版）》[5]中甲基丙二酸血症诊断标准；均为足月患儿。排除标准：心、肺功能障碍患儿；合并感染性疾病患儿；合并颅内出血患儿；合并贫血患儿。

1.2 方法

1.2.1 串联质谱检测将3 mm干滤纸（相当于3.2 μL全血）放入96孔U形板中，在样品测定试剂盒中设置质量控制点，高、低浓度质控血点每板设置2孔，以保证检测质量。串联质谱仪采用美国生物应用系统公司生产的API 2000型/API4000型。静脉抽血或手指采血，滴于采血滤纸上，晾干后送检。采用非衍生化方法进行处理，每个孔内加入100 μL萃取液和内标混合物（美国PE公司，非衍生化串联质谱检测试剂盒）。萃取液在45℃下密封，恒温振荡45 min，然后将提取液转移到96孔U形板上检测，用铝膜覆盖，室温保存2 h，即可对样品进行检测。数据采集采用电喷雾正离子扫描和多反应监测模式。样本测定时间为3 min，进样量15 μL。检测血液中C3及C3/C2水平。

1.2.2 高效液相色谱检测静脉抽血或手指采血，滴于采血滤纸上，晾干后送检。用直径为3 mm的穿孔机从初始血点样本中取出3个血点，放入96孔U形板中，向每个孔中加入含内标甲醇和二硫苏糖醇（DTT）溶液，室温放置20 min，然后将上清液转移至96孔V形板中，在55℃下干燥，加入盐酸正丁醇，用聚四氟乙烯膜覆盖，置于65℃恒温箱中15 min，然再以55℃吹干，加入乙腈，用铝膜覆盖，即可进行液相色谱检测。采用日本岛津公司生产的20ADXR型高效液相色谱仪，检测血液中的甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平。

1.3 观察指标正常人血液中C3及C3/C2的参考值为0.50～4.00 μmol/L、0.04～0.25；正常人血液中甲基丙二酸、甲基枸橼酸的含量为0.2～3.6、0.0～1.1。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，比较采用t检验，绘制ROC曲线并计算曲线下面积（AUC）值，AUC值＞0.90表示诊断性能较高，0.71～0.90表示诊断性能较为理想，0.50～0.70表示诊断性能较差，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平比较研究组C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平比较（±s）Table 1 Comparison of C3,C3/C2,methyl malonic acid and methyl citrate between the two groups(±s)

表1 两组C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸橼酸水平比较（±s）Table 1 Comparison of C3,C3/C2,methyl malonic acid and methyl citrate between the two groups(±s)

注：C3，丙酰基肉碱，C2，乙酰基肉碱

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2.2 串联质谱、高效液相色谱联合检测对新生儿MMA的评估价值分析绘制ROC曲线，结果显示，串联质谱中C3及C3/C2对新生儿MMA诊断的曲线下面积分别为0.790、0.883，高效液相色谱中甲基丙二酸及甲基枸橼酸对新生儿MMA诊断的曲线下面积分别为0.889、0.992，诊断效能较理想；联合诊断对新生儿MMA诊断的曲线下面积为0.997，诊断效能较高，见表2、图1。

图1 串联质谱、高效液相色谱联合检测对新生儿MMA的评估价值ROC曲线图Figure 1 ROC curve of the evaluation value of tandem mass spectrometry and high performance liquid chromatography for neonatal MMA

表2 串联质谱、高效液相色谱联合检测对新生儿MMA的评估价值Table 2 Evaluation value of combined tandem mass spectrometry and high performance liquid chromatography for neonatal MMA

3 讨论

MMA是临床常见的有机酸血症，因其甲基丙二酰辅酶A变位酶及其辅酶钴胺（cobalamin，CBL）的缺陷，甲基丙二酰辅酶A在缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和奇碳脂肪酸的分解代谢过程中不能转化为琥珀酰辅酶A，且旁路代谢增强，导致甲基丙二酸、甲基枸橼酸及丙酸的异常积累，引起脏器多处损伤，尤其是神经系统损伤。体内积聚的有机酸与CO结合，转化为酰基肉碱代谢，因此，MMA患儿体内中C3、甲基丙二酸和甲基枸橼酸含量增加[6-7]。MMA患者的主要临床表现为嗜睡、抽搐、反复呕吐、呼吸困难、肌张力减退、运动障碍和代谢性酸中毒，如不及时诊治，死亡率可高达80%，即便幸存也多会有智力低下、生长发育迟缓等后遗症，因此，早期筛查尤为重要[8]。

串联质谱检测血C3、C3/C2水平和高效液相色谱检测血甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平是诊断新生儿MMA的有效检测方法，同时伴有其他有机酸或酰基肉碱的变化。高效液相色谱可检测多种有机酸水平，其中甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平升高是诊断新生儿MMA的特异性指标[9-10]。本研究结果显示，研究组C3、C3/C2、甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。绘制ROC曲线，结果显示，联合诊断对新生儿MMA诊断的曲线下面积为0.997，诊断效能高于串联质谱、高效液相色谱单独检测，证实甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平诊断新生儿MMA的可靠性，但在其他疾病继发性酸中毒或慢性病引起维生素B12吸收障碍时，甲基丙二酸排出量也可能略有增加，而血C3水平和C3/C2通常维持正常水平[11]。因此，对于甲基丙二酸水平稍有升高的患者，需联合血液串联质谱结果进行综合分析。串联质谱法检测血液中C3和C3/C2对该病的诊断具有重要意义，有研究结果证实，综合分析血液中C3和C3/C2水平可使诊断的特异性提高至99.903%[12-13]。因此，联合串联质谱、高效液相色谱诊断新生儿MMA诊断效能较高。

综上所述，C3、C3/C2、甲基丙二酸、甲基枸橼酸在新生儿MMA患儿中明显升高，联合串联质谱、高效液相色谱应用具有较高的诊断效能。