超声辅助法与闪式提取法提取五味子醇甲的工艺对比研究

崔悦，周新新，2，李雨轩，2，李乐乐，林晓影，冯波，关皎*，朱鹤云*

（1.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013；2.延边大学药学院，吉林 延吉 133002）

五味子又称五梅子、山花椒，是木兰科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效[1-2]。五味子因具有“甘、酸、辛、苦、咸”五味而得名，在我国东北地区产量丰富，作为一种药食同源的植物，五味子具有非常重要的药用和食用价值。研究表明，五味子对消化系统、心血管系统、免疫系统等具有较好的保护作用[3-4]。此外，其亦可制为五味子酒、五味子饮料、五味子果酱等多种功能性食品[5]。在《中国药典》（2020版）中，五味子药材的质量以五味子醇甲为指标进行控制。五味子醇甲为木脂素类化合物，是五味子的主要化学成分，文献报道其具有保肝、抗炎、抗凝血等多种药理活性[6-9]。

目前，五味子醇甲的提取方法包括超声法[10-12]、渗漉法[13]和回流法[14]。其中，超声法是一种常用的药材提取方法，利用超声波振动的空化等作用，在振荡过程中，空化泡周围的微流会对溶液中的药材产生切向力，进而使得溶剂加速渗透到细胞当中，溶解出药材细胞中的有效成分，提取出药材成分[15]。超声功率、时间等都会影响到药材的提取率。目前，超声法已广泛应用于多种化学成分的提取，如多糖、苷类、黄酮和生物碱等[16-17]。闪式提取法又称组织破碎提取法，最早源于生物组织的捣碎，后来被逐渐开发和创新出用于植物组织捣碎，并用于对中药材的提取[18]。文献报道连翘果实总黄酮、白蔹多糖等都可采用闪式提取法提取[19-20]，具有省时、稳定、节能等优点。

本研究将通过比较超声辅助提取法和闪式提取法对五味子中五味子醇甲的提取率的影响，优选出五味子醇甲的最佳提取工艺，为五味子醇甲的大规模提取和五味子开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

五味子果实：吉林市吉林大药房；五味子醇甲对照品（纯度＞98%，批号：Y17M8H31887）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱级）：Fisher公司；无水乙醇（分析纯）：永大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（LC-20AT）：日本岛津公司；微型万能粉碎机（FW80）：天津市泰斯特仪器有限公司；电子天平（FA1104N）：上海精密科学仪器有限公司；闪式提取器（JHBE-50S）：河南金鼐科技发展有限公司；三频恒温数控超声波清洗器（KQ-500GVDV）：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的预处理

取适量干燥后的五味子药材于药材粉碎机中，粉碎，备用。

1.3.2 超声辅助提取方法

取五味子药材粉末5 g，加入50%乙醇250 mL，采用超声辅助进行提取，提取功率为150 W，超声时间为0.75 h，提取液用0.22 μm微孔滤膜过滤，待用。

1.3.3 闪式提取方法

取五味子药材粉末5 g，加入50%乙醇250 mL，闪式提取3 min，提取液用0.22 μm微孔滤膜过滤，待用。

1.3.4 单因素试验

超声辅助提取法单因素试验考察的因素为乙醇浓度（10%、30%、50%、70%、90%、100%）、超声时间（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 h）、超声功率（50、100、150、200、250 W）和料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]，固定因素为乙醇浓度50%、超声时间0.75 h、超声功率150 W、料液比 1∶50（g/mL）；闪式提取法单因素试验考察因素为乙醇浓度（10%、30%、50%、70%、90%、100%）、提取时间（1、2、3、4、5 min）和料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]，固定因素为乙醇浓度 50%、提取时间3 min、料液比 1∶50（g/mL）。考察以上各因素不同水平对五味子醇甲提取率的影响。

1.3.5 五味子醇甲含量测定

1.3.5.1 色谱条件

色谱柱采用Shim-pack GIST柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相采用 0.1%甲酸-甲醇（35∶65，体积比），检测波长为250 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，取样品10 μL分析。

1.3.5.2 对照品溶液的制备和标准曲线的绘制

以甲醇为溶剂制得1.0 mg/mL的五味子醇甲对照品储备液，备用。

取五味子醇甲对照品储备液适量，用甲醇做溶剂配制成五味子醇甲系列对照品溶液，浓度分别为5、10、20、50、100、200 μg/mL，进样分析，以峰面积（Y）为纵坐标，五味子醇甲溶液的浓度为横坐标（X），得到五味子醇甲的线性回归方程为Y=2.086×104X-4.112 3×103（R2=0.999 9），五味子醇甲的线性范围为 5 μg/mL～200 μg/mL。

1.3.5.3 精密度试验

取五味子醇甲50 μg/mL对照品溶液适量，按1.3.5.1色谱条件连续进样6次，峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.06%，即仪器精密度良好。

1.3.5.4 稳定性试验

取同一批五味子药材粉末，按1.3.2方法得供试品溶液，分别将样品放置 0、2、4、8、12、24 h 后进行色谱分析，峰面积的RSD为1.01%，即样品在24 h内稳定。

1.4 正交试验

选取不同的影响因素和各因素的不同水平，以L9（34）设计正交试验，以五味子醇甲的提取率为考察指标。各项试验平行3次。超声辅助提取法正交试验因素水平见表1，闪式提取法正交试验因素水平见表2。

表1 超声辅助提取法正交试验因素水平Table 1 Orthogonal experimental factor levels of ultrasonic-assisted extraction

表2 闪式提取法法正交试验因素水平Table 2 Orthogonal experimental factor levels of flash extraction

1.5 数据分析

采用正交设计助手oea_v31p进行数据分析，优化最佳提取工艺，采用Origin 8.5软件制图。

2 结果与分析

五味子醇甲对照品和五味子样品的色谱图见图1。

图1 五味子醇甲和五味子样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of schizandrin reference and Schisandrae chinensis Fructus sample

由图1可知，该色谱条件下五味子样品中五味子醇甲分离良好，无干扰。

2.1 超声辅助提取五味子醇甲的单因素试验结果

超声辅助提取五味子醇甲的单因素试验结果见图2。

图2 超声辅助法不同因素对五味子醇甲提取率的影响Fig.2 Effects of different factors on schizandrin extract rates by ultrasonic-assisted extraction

由图2a可知，五味子醇甲的提取率随乙醇浓度的增大先升高后降低，在乙醇浓度90%时达到最大值。因此，选择90%为乙醇的适宜浓度。由图2b可知，五味子醇甲的提取率随超声时间的增大而升高，最后趋于稳定。当超声时间达到0.50 h后，提取率保持平稳。因此，0.50 h为适宜的超声时间。由图2c可知。五味子醇甲的提取率随超声功率的升高而增大，考虑到超声仪的额定功率为250 W，因此，在试验范围内选择提取的超声功率为250 W。由图2d可知，随着溶剂体积的增大，五味子醇甲的提取率先增大后减小，当料液比达到1∶60（g/mL）时五味子醇甲的提取率达到最大值。因此，提取的适宜料液比为1∶60（g/mL）。

2.2 闪式提取五味子醇甲的单因素试验

闪式提取五味子醇甲的单因素试验结果见图3。

图3 闪式提取法不同因素对五味子醇甲提取率的影响Fig.3 Effects of different factors on schizandrin extracts rates by flash extraction

由图3a可知，五味子醇甲的提取率随乙醇浓度的增大先升高后降低，在乙醇浓度90%时达到最大值。因此，选择90%为乙醇的适宜浓度。由图3b可知，五味子醇甲的提取率随提取时间的增大而升高，最后趋于稳定。当提取时间达到3 min后，提取率保持平稳。因此，3 min为适宜的提取时间。由图3c可知，随着溶剂体积的增大，五味子醇甲的提取率先增大后减小，当料液比达到1∶60（g/mL）时五味子醇甲的提取率达到最大值。因此，提取的适宜料液比为1∶60（g/mL）。

2.3 超声辅助提取五味子中的五味子醇甲最佳工艺的确定

2.3.1 正交试验设计及结果

以乙醇浓度（A）、超声时间（B）、超声功率（C）和料液比（D）为4个试验因素，各因素设置3个水平。超声辅助提取法的正交试验和方差分析结果分别见表3和表4。

表3 超声辅助提取法正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of ultrasonic-assisted extraction

表4 超声辅助提取法方差分析结果Table 4 Variance analysis results of ultrasonic-assisted extraction

由表3可知，超声辅助提取方法中各因素对五味子醇甲提取率的影响顺序为D>B>C>A。表4方差结果表明，各因素不会显著性影响提取工艺。筛选得到的超声辅助提取法最佳工艺为A1B3C2D3，即50%乙醇，提取 1.00 h，功率 200 W，料液比 1∶60（g/mL）。

2.3.2 验证试验

取供试品溶液，对最优工艺A1B3C2D3进行验证（n=3），计算后五味子醇甲平均提取率为4.72 mg/g，高于正交试验的最高提取率（4.68 mg/g）。

2.4 闪式提取法提取五味子中的五味子醇甲最佳工艺的确定

选取乙醇浓度（E）、料液比（F）、提取时间（G）3个试验因素。闪式提取法正交试验和方差分析结果分别见表5和表6。

表5 闪式提取法正交试验结果Table 5 Orthogonal test results of flash extraction

表6 闪式提取法方差分析结果Table 6 Variance analysis results of flash extraction

由上述结果，通过比较各试验条件下五味子醇甲的提取率可知：各因素对五味子醇甲提取率的影响顺序为E>F>G。方差结果表明：各因素不会显著性影响提取工艺。筛选得到的闪式提取法最佳工艺为E2F2G3，即 70%乙醇，料液比 1∶50（g/mL），提取 3 min。

2.5 超声辅助提取法与闪式提取法的比较

分别用超声辅助提取法和闪式提取法最佳工艺提取五味子醇甲，结果见表7。

表7 不同提取方法五味子醇甲的提取率Table 7 The extraction rates of schizandrin by different extraction technologies

由表7可知，超声辅助法的提取率为4.72 mg/g，闪式提取法的提取率为5.02mg/g。通过比较，闪式提取法提取五味子醇甲的提取率更高，且其提取时间仅为3 min，而超声辅助法的提取时间为60 min，显然，闪式提取法更加省时、高效，较适合对五味子醇甲的大规模提取。

3 结论

本研究将超声辅助法和闪式提取法提取五味子中的五味子醇甲的工艺进行比较研究。结果表明，闪式提取法提取效率更高，且具有省时、简单、高效等优点。确定的最佳提取工艺为闪式提取：以70%的乙醇作为提取溶剂，料液比为 1∶50（g/mL），提取时间为 3 min。在此工艺下，五味子醇甲的提取率为5.01 mg/g。五味子作为一种药食同源的植物，具有极高的药用和食用价值。采用最佳的提取工艺对五味子醇甲进行提取，能够大大提高其提取效率，对于扩大五味子的市场应用具有非常重要的意义。本研究可为五味子醇甲的大批量生产开发提供理论依据。