火腿微生物发酵剂研究进展

赵婧含鞠铭孙德鹏董微巍朴春香

(1.延边大学农学院,吉林 延吉 133002；2.延边大学食品研究中心，吉林 延吉 133002；3.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心,吉林 延吉 133002)

西式发酵火腿是以猪后腿肉为原料，通过不同技术进行腌制，再经过干燥(烟熏或不烟熏)达到成熟后制成的肉制品。这种类型的火腿具有稳定的色泽、典型的芳香气味和紧实的质地，可以直接食用。西式发酵火腿种类繁多，不同品牌火腿的生产技术和感官属性也大不相同，而风味是影响火腿整体接受度的一个关键因素，其受到火腿原料、加工技术和成熟时间的显著影响。火腿是经过发酵和长时间的成熟生产出来的。6～30个月的成熟期促进了西式发酵火腿典型风味的形成[1]。其中的风味化合物主要来源于蛋白水解、脂解、糖酵解和次生代谢产物。西式发酵火腿中蛋白质含量相对较高，蛋白质被微生物转化为多肽，并进一步转化为各种氨基酸。氨基酸被确定为许多挥发性化合物的前体，包括发酵过程中产生的酮、醛、醇、酸、酯、烯烃和烷烃。源于支链氨基酸转氨作用的风味化合物(BCAAs，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)因其类型复杂、丰度高和风味阈值低而受到关注，这突出了其在发酵肉风味发展中的重要作用。在肉制品中，支链醛类是最丰富的风味化合物，包括通过亮氨酸的转氨基作用和α-酮基异抑肽酶的进一步脱羧作用产生的3-甲基丁醛。因此，在乳酸菌发酵过程中，提高支链氨基酸衍生的挥发性化合物对发酵肉的风味至关重要。发酵肉成熟过程中的分解代谢主要是由微生物氨基转移酶的作用引起的。包括乳酸菌(LAB)在内的许多微生物参与了亮氨酸向3-甲基丁醛的转化。

发酵剂是指活的或休眠状态的微生物制剂，理想的发酵剂在促进肉制品发酵的同时，还起着抑菌防腐、保证质量的作用，且能产生良好的代谢活性，从而改善发酵肉制品的感官品质[2]。自然发酵肉制品的历史悠久，1940年，詹森和帕多克开始使用乳酸菌生产发酵香肠，乳酸菌可以利用碳水化合物发酵产生乳酸和其它香气化合物[3]。葡萄球菌是近年来使用最广泛的微生物发酵剂[4]，凝固酶阴性葡萄球菌是发酵产品中通过降解支链氨基酸和脂肪酸而形成颜色和风味所必需的[5]，其能够迅速减弱肉制品的产酸能力，缩短发酵成熟期，抑制肉的腐烂和致病微生物的繁殖，从而提高产品品质。毫无疑问，接种发酵剂是以较短的发酵时间和高质量生产安全产品的重要工具。目前，微生物在肉制品中的应用越来越广泛，而且在成熟过程中，微生物对火腿风味的形成有促进作用[6]。因此，本文总结了不同微生物发酵剂在火腿发酵中的应用，以期通过加入微生物来改善火腿的风味，为火腿生产提供理论依据。

1 不同微生物发酵剂在火腿发酵中的应用

1.1 凝固酶阴性葡萄球菌

由于凝固酶阴性葡萄球菌是生腿腌制后自生菌群的一部分，因此很可能成为火腿发酵剂中的候选者。一些凝固酶阴性葡萄球菌，如肉葡萄球菌(S.carnosus)和木糖葡萄球菌(S.xylosus)，作为发酵肉制品中的发酵剂具有悠久的历史[7,8]，其在火腿发酵过程中可以改善色泽并产生香气。这些积极的影响是由于不同的代谢活动(如硝酸盐还原和蛋白水解)所引起的，其通常也能够在高盐浓度下生长。与木糖葡萄球菌和马胃葡萄球菌(S.equorum)相比，Søndergaard和Stahnke[9]研究的肉葡萄球菌菌株比这2个物种的耐盐性更高。研究表明，某些肉葡萄球菌能够在氯化钠浓度为15%～20%的条件下生长[10]。

在腌制的生腿上或在火腿加工使用中发现的2个主要菌种是木糖葡萄球菌(S.xylosus)和马胃葡萄球菌(S.equorum)。尽管木糖葡萄球菌以香肠模型系统中的香气产生而闻名，但尚无关于将木糖葡萄球菌用作火腿中单一菌株发酵剂培养物的研究报道。Sánchez Molinero和Arnau[11]进行的火腿实验中使用的木糖葡萄球菌是市售发酵剂的一部分。在火腿中作为微生物发酵剂的马胃葡萄球菌也很少见，Hammes和Hertel[12]则认为,马胃葡萄球菌适合作为火腿发酵剂，因为该物种的菌株可以在低于10℃的温度下生长良好。发酵剂的使用始于添加微球菌属和葡萄球菌属(凝固酶阴性球菌——CNC)菌株，使得颜色更好，降低pH值，抑制病原微生物，降低工艺的经济要求，并对火腿的风味和颜色作出了积极贡献。

1.2 乳酸菌(LAB)

作为大多数肉类加工所使用发酵剂的一部分，在一些研究中已经测试了乳杆菌属并将其用于火腿发酵。乳酸菌能代谢碳水化合物主要产生乳酸，以及少量乙酸、二乙酰。还可产生肽酶和氨肽酶以及通过降低pH提高组织蛋白酶的活性，从而直接或间接参与蛋白质降解。Toledano等[13]研究了11种市售乳酸菌菌株对猪肉肌球蛋白的水解能力，用来测定蛋白质水解是否影响西式发酵火腿的最终风味；提出嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)可以作为候选发酵剂，显示出了对肌球蛋白的高水解活性。Alicia Rodriguez等[14]在西式发酵火腿表面使用商业发酵剂，除了葡萄球菌和霉菌外，还包括沙克乳杆菌和戊糖乳杆菌(L.pentosus)菌株，以研究发酵剂对气味、风味和外观的影响；其认为加入发酵剂处理的西式发酵火腿存在感官特性的差异，改善了火腿的风味。Md.Kauser-Ul-Alam等[15]研究LAB作为发酵剂代替亚硝酸盐改善肉制品色泽，对其在不同条件下的表型特性进行了研究。在乳酸菌中，片球菌属和乳杆菌属菌株已被广泛研究并用作发酵剂，如乳酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、萨基乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、戊糖乳杆菌和干酪乳杆菌。此外，乳酸菌还可以用作其它腌肉制品的发酵剂。

1.3 霉菌和酵母菌

脂解和蛋白质水解的过程会提高火腿的感官质量[16,17]。据报道，普通青霉(P.commune)、产黄青霉(P.chrysogenum)、纳地青霉(P.nalgiovense)和枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)菌株显示出高脂解和蛋白水解活性，被认为可以增强最终产品的典型风味。

为了筛选适当的发酵剂，Ockerman等[18]从西班牙火腿表面分离出5株青霉属菌株，并在肉模型中测试了风味。黄灰青霉(P.aurantiogriseum)和沙门柏青霉(P.camemberti)菌株在3～8℃的范围内提高了火腿的风味品质，但超过12℃时风味品质降低。这些结果有力地表明，不同挥发性化合物的产生依赖于菌株。Andrade等[19]的研究证实了这一点，其从伊比利亚火腿中分离出117种酵母菌株，主要是汉逊德巴利酵母(D.hansenii)和涎沫念珠菌(C.zeylanoides)，并比较了体外58种挥发性化合物的产量，在未接种的对照品与汉逊德巴利酵母和涎沫念珠菌的接种批次之间，检测到挥发性化合物(支链醛、醇和酮)的含量差异。有人建议将汉逊德巴利酵母的2种生物型作为火腿发酵剂中的主要微生物，因为其对西式发酵火腿的风味化合物的产生有很大影响，如3-甲基丁醛[20]。在猪里脊肉中测试了产黄青霉(P.chrysogenum)和汉逊德巴利酵母(D.hansenii)对蛋白水解过程和挥发性化合物形成的影响。与汉逊德巴利酵母相反，产黄青霉(P.chrysogenum)对肌原纤维蛋白具有蛋白水解活性，并导致氨基酸分解及其代谢衍生化合物的增加，如羧酸和支链醛。汉逊德巴利酵母的应用能够产生更高浓度的环醇和芳香醇。Rodríguez等[21]对伊比利亚干腌火腿中分离出来的微生物蛋白水解酶活性进行评价，发现产黄青霉对干腌肉制品中蛋白质的水解起重要作用，能显著提高火腿中游离氨基酸的含量。多数霉菌在人工培养基上可以产生霉菌毒素，因此霉菌发酵剂需验证安全无毒后方可应用，产黄青霉和纳地青霉是常用的不产毒霉菌发酵剂[22]。

1.4 混合菌种发酵剂

目前，乳酸菌和凝固酶阴性葡萄球菌被认为是肉类发酵中2种重要的细菌，其抗菌代谢产物(包括有机酸、溶菌酶和过氧化氢)是抑制病原菌的最重要因素[23]。凝固酶阴性葡萄球菌有助于抑制脂质氧化和亚硝酸盐肌肉蛋白的形成，促进硝酸盐的还原能力[24]。有些葡萄球菌也参与了蛋白水解和脂解，如金黄色葡萄球菌。在发酵过程中，蛋白质水解决定了发酵肉的感官和营养特性[25-29]。近十年来的许多研究表明，蛋白质水解不仅与内源酶的活性有关，还与某些细菌群有密切联系，如葡萄球菌[30-32]。葡萄球菌在肉类发酵过程中蛋白质分解受到乳酸菌的影响[33]。因此，在筛选多菌种发酵剂时，应考虑乳酸菌和葡萄球菌之间的协同作用[34]。

Tremonte等[35]认为，葡萄球菌和肺炎链球菌混合培养比单一培养葡萄球菌效果更好。混合发酵过程中微生物的相互作用以及葡萄球菌蛋白水解能力对发酵质量的影响尤为重要。从传统肉制品中分离的微生物有望成为肉类发酵的候选菌种，其对肉中的环境有很好的适应性[36]。从自然发酵中分离出来的乳酸菌和葡萄球菌可以根据特定的代谢活性提供独特的诱人香味[37-39]。王永霞等[40]从20多种传统发酵肉制品中分离出菌株198株，并筛选出2株过氧化氢酶阳性球菌，初步鉴定为肉糖葡萄球菌(StapHylococcus carnosus)S15和S113，并研究了戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P20、米酒乳杆菌(Lactobacillus sake)J17分别同2株葡萄球菌在模拟肉汤中混合培养的相互关系，初步确定了混合肉品发酵剂P20加 J17可以改善火腿的品质。在Schlafmann等[41]的研究中，将马胃葡萄球菌与嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)结合用于西式发酵火腿模型系统中，总体上改善了火腿品质并减少金黄色葡萄球菌的数量。在Black Forest火腿的生产中发现，联合菌种实现了颜色的改善，并且金黄色葡萄球菌的数量减少了3～5log cfu·g-1。Chen等[42]还研究了3种乳酸菌(戊糖乳杆菌、弯曲乳杆菌和萨凯乳杆菌)和1种葡萄球菌(木糖乳杆菌)对发酵肉制品中脂类和蛋白质氧化水解的影响。研究结果表明，细菌发酵可以抑制肉中蛋白质和脂类的氧化，促进肉中蛋白质和脂类的水解，从而改善其风味和感官品质。

2 微生物发酵剂对火腿安全性的影响

有学者将有硝酸盐还原酶活性的凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)或微球菌添加到西式发酵火腿中，该菌使火腿中的NO3-还原为NO2-。研究表明，具有高硝酸还原酶活性的微生物可以弥补火腿颜色缺陷和降低生火腿产品中残留的硝酸盐含量[43]。在Bosse等[44]的研究中，将2种不同的肉葡萄球菌用作北欧火腿的发酵剂，以研究其不同的硝酸还原酶活性以及对最终产品的颜色形成、硝酸盐和亚硝酸盐含量的影响。1株LTH 7036菌种在体外显示出较高的硝酸盐还原能力，另1株LTH 3838菌种却相反。同样，在火腿内部也观察到了这些影响，接种LTH 7036的火腿比接种LTH 3838的火腿产生更高的亚硝酸盐含量和更低的硝酸盐含量，LTH 3838菌株在体外还具有针对肌浆蛋白的水解活性。Héquet等[45]在火腿中对比使用了产细菌素的清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)2512 和不产细菌素的清酒乳杆菌L110，虽然二者有相似的培养基酸化速率，但产细菌素的处理组中英诺克李斯特菌(Listeria innocua)的数量更低，且整个贮藏期60d内目标菌株均未显著生长。Ramaroson等[46]发现,在接种乳酸菌的火腿中除精胺外的生物胺产量极少，这也可能包括了肉中自然存在的精胺。

霉菌和酵母菌的应用有时也能有助于提高产品的安全性。Rodríguez等[47]在伊比利亚火腿上施用了产黄青霉RP42C，结果表明，减少了产生OTA的霉菌数量。这些发现也得到了其它研究的证实。如，Comi[48]和Iacumin将霉菌和酵母菌，如纳地青霉(P.nalgiovense)、季也蒙假丝酵母(C.guilliermondii)和扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)应用于火腿的表面，同时接种产毒霉菌，结果显示，其有效地阻止了产OTA霉菌的生长，从而抑制毒素的产生。Virgili等[49]还用分离自意大利发酵火腿的12种酵母菌株在体外进行研究，即使通过增加真菌接种量具有降低酵母拮抗作用的潜力，但氯化钠的存在却起到增强作用。在另一项研究中，Simoncini等[50]研究了汉逊德巴利酵母78菌株、马拉马氏酵母(D.marama)51菌株和伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)120菌株在肌肉中的繁殖能力；发现汉逊德巴利酵母(D.hansenii)78菌株、马拉马氏酵母51菌株均能够在肌肉中稳定繁殖，而马拉马氏酵母51菌株最能满足作为微生物发酵剂的要求，由于伯顿丝孢毕赤酵母120菌株不能在意大利发酵火腿的表面繁殖，因此被排除在潜在的发酵剂之外。

3 微生物发酵剂的生存方式

在食品系统中应用微生物发酵剂时会面临2个挑战，即引入的方式；发酵剂是否能够在给定加工条件的食品系统中生存并进行所需的代谢活动。尽管发酵剂适用于肉类发酵，但到目前为止，其应用主要局限于发酵香肠。将其与香肠肉混合可以很容易地引入，而在火腿中，则必须将其引入整个肌肉系统并且不会破坏火腿的质地结构。可以通过在火腿表面涂抹或喷雾的形式添加发酵剂，验证微生物是否能进入肌肉内部，在不同的研究中已经有学者对这种形式进行实验。在腌制之前或之后将马胃葡萄球菌(S.equorum)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和干酪乳杆菌(L.casei)摩擦在整个肉块的表面上。在最终产品中，乳酸菌主要位于表面，而葡萄球菌则位于内部，这表明微生物在整个肌肉块都有迁移。在Bosse等[51]的研究中，细菌迁移到肌肉组织中的有效扩散系数被确定为1.9×10-10～1.1×10-8m2·s-1。除了喷洒之外，在添加了发酵剂的盐水中浸泡也可以用于将发酵剂转移到肉中。浸泡在添加肉葡萄球菌和植物乳杆菌(L.plantarum)的盐水中，腌制结束后，从产品中检测出该微生物数量增加。如果要在腌制的生腿内部应用微生物，则可以通过注射的方式引入[51]。已经有人应用该技术注入肉葡萄球菌、植物乳杆菌(L.plantarum)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、清酒乳杆菌(L.sakei)和变异微球菌(M.Varians)。尽管仅注射就足以将细菌引入到肉类结构中，但是其它过程，如翻滚、真空浸渍、真空翻滚和冻融等也有助于其均匀分布。这些操作程序和每一个不同注射位置都为相应的微生物提供了不同的环境；施加到肌肉内部为微生物提供厌氧环境，而表面微生物则不需要。

北欧风格的火腿如果在加工开始时应用发酵剂，则微生物必须能够在烟熏处理中存活；南欧风格的火腿则不需要这个条件。南欧风格的火腿中被经常用作表面发酵剂的霉菌是原生微生物群的一部分，但这种微生物很少在北欧风格的火腿中使用。这种差异可能是由烟熏引起的，但到目前为止，尚无研究调查烟熏西式发酵火腿对表面微生物影响的研究。通常，在腌制过程中约5℃的低温会抑制微生物的生长，因此，要选用微生物发酵剂，至少可以耐受该温度，如清酒乳杆菌(L.sakei)。生腿腌制过程中微生物存活的另一个障碍是氯化钠的含量相对较高，最高可达5%。因此，用作发酵剂的微生物必须具有耐盐性并能适应这种特定的腌制条件。

4 结论与展望

微生物发酵剂的高产酸和快速降低火腿水分活性的能力，有利于缩短肉制品的发酵成熟期；而发酵肉制品的低pH值，不仅能够抑制细菌和病原体的生长以及毒素的产生，还有利于促进产品干燥。火腿生产中的一些困难，特别是产品安全性的问题，可以通过使用发酵剂来解决。但是，由于存在不同的障碍和环境条件，将生产发酵香肠使用的发酵工艺应用到火腿生产中并不适用。对于微生物发酵剂，引入技术以及其对火腿实际影响的进一步研究是非常令人感兴趣的。发酵剂的筛选优化也将会成为国内外研究的重点，特别是在混菌发酵方面，筛选出2种或多种没有互补拮抗作用的混合发酵剂也将成为发酵肉制品研究领域的热点。