苹果花叶病研究进展

李春霞

(延安职业技术学院,陕西 延安 716000)

0 引言

我国苹果栽培面积和产量均居世界第一。延安地处西北黄土高原中部，由于海拔高、日照时间长，昼夜温差大，被世界公认的最佳苹果优生区，生产的苹果深受国内外市场的青睐。苹果栽培分布在全市13个县区，且面积和规模迅速扩大。根据立地条件，分为旱塬苹果(南部5个县)和山地苹果(北部8个县(区))两大产区。2020年全市苹果面积达到26.67万hm2，产量达到400万t，苹果产业已经成为延安的主导产业和农民脱贫致富奔小康的主要途径，同时对水土保持和生态绿化建设发挥重要作用。

苹果花叶病( Apple Mosaic)在国内外苹果种植区普遍存在[1～3]。近年来，随着栽培面积的迅速扩大，育苗规模扩大，苗木的频繁调运，花叶病日趋严重，成为苹果生产中危害严重且难防治传染病之一，给苹果高产优质带来很大影响，为此，笔者通过大量田间观察调查和查阅资料，从苹果花叶病危害、病原种类及鉴定方法、防治措施等方面进行了概述，为人们更加全面认识苹果花叶病和后续研究提供参考。

1 苹果花叶病的危害

苹果花叶病病毒主要危害叶片，除侵染苹果外，还侵染梨、花红、桃、樱桃、山楂、木瓜等蔷薇科果树植物[4],1963年Kristensen和Thomsen 通过调查和试验发现苹果花叶病毒科侵染19个属的65种植物[5]。

1.1 对生长结果的影响

经田间观察和查阅资料证实，一年生枝条感染病后，节间变短，树体生长缓慢，延迟结果；多年生树感病后，削弱树势，枝叶生长缓慢，不易成花，即使结果，在6月份也容易落果，果实小、畸形果多、味淡、不耐贮藏，降低产量和品质，严重者造成早期落叶[6～8]。

王永宗调查认为，苹果花叶病主要发生在老龄果树，严重老龄果园发病率在20%，平均减产在30%左右[9]。但经本人近10 a在延安13个县田间调查观察，随着苹果栽植面积的不断扩大，除了20多年老龄果园花叶病越来越重外，新栽幼树和未结果树也很严重，甚至在一千多亩高标准新建示范园中，有的地块病株率达到15%～25%，严重影响果树早果丰产。

1.2 对叶绿素含量和光合作用的影响

花叶病造成品质和产量是由于影响叶绿素和花青素的含量。柴光臻等研究表明，苹果花叶病能显著降低苹果叶片叶绿素含量和叶片净光合速率[10]；田明璐研究结果表明，随着病害严重程度的增大,苹果叶片的花青素含量升高[11]。

1.3 对细胞形态结构的影响

Fulton等对苹果花叶病毒粒体的研究发现，花叶病毒在体外非常不稳定，在54℃的热稳定性只有10 min，在含0.02M2-巯基乙醇的缓冲液中只能保持2～3 h的侵染活性。电镜观察发现苹果花叶病毒粒子的大小为25 nm或29 nm[12]。张明珍选用花叶病毒叶片进行超薄电镜切片观察，发现苹果花叶病叶片的细胞发生明显变化，病毒粒以分散的长线状形式聚集排列在细胞质中，叶绿体畸形且数目减少，淀粉粒膨胀、增多，在叶绿体内发现有铁蛋白存在，远离细胞壁[13]。

2 苹果花叶病症状表现

苹果花叶病症状表现受病原株系、环境条件影响(尤其是温度、光照等因素)变化较大。主要症状类型有斑驳型、花叶型、网斑型、云斑型、环斑型、镶边型及以上症状的混合型，枝条和果实则没有明显病症[3,13]。

在田间同一株、同一枝或同一叶片常常出现不同症状 ，但以花叶型、斑驳型和云斑型几种类型居多。成年树上的症状发展较慢，并且表现在部分枝条上，常经过几年后仍然局限于部枝纸条上；但在苗木上则发展很快，在发病当年即可全株出现症状。

3 果树病毒的检测方法

果树病毒检测方法随着科学技术发展而不断提高，由最初的生物鉴定，增加了血清鉴定、电子显微技术鉴定、荧光鉴定及分子生物学鉴定等多种方法，各种方法各有优势，取长补短，相互配合，使得检测时间不断缩短，准确性不断提高。

3.1 生物学检测(即指示植物法)

这是一种比较传统的病毒检测方法(也叫指示植物法)。即利用指示植物对病毒敏感性进行测试。当指示植物受不同病毒侵染时，能够快速显现出不同的生物学症状，根据特异性生物学症状表现判断病毒的种类。这种方法简单、方便、直观、成本低，可在大田、温室或试管嫁接方法，但因速度慢且灵敏度低。

3.2 血清学检测

主要是指酶联免疫吸附分析方法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA法)。该方法实验成本低、简单、特异性好、快速，能够对大量样品进行快速、灵敏、准确的检测，是当前植物病毒检测中应用最广泛的方法。但是ELISA法的准确性往往依赖于抗血清的品质以及病毒浓度。不同实验材料、组织部位、取样时间，样品中病毒浓度变化差异较大，会导致ELISA检测结果出现假阴性[14]。温度过高会降低样品中的病毒含量，降低ELISA检测结果的可信度。此外，病毒变异较快、株系复杂，容易导致特定病毒抗体不能识别特异抗原或识别程度下降，从而导致漏检或错检[15]。杜国荣等研究表明，病毒浓度低的寄主植物中的病毒不易被检测到[16]。

3.3 电子显微检测

电子显微镜检测可以准确、直观的看到病毒性态结构、在寄主细胞内存在状态以及引起寄主细胞的病变和内含体特征，是深度研究引起病变细胞超微结构变化和细胞学方面的重要手段。但是电镜仪器昂贵、操作复杂，技术水平要求高。这种方法不适于大量样本检测[17]。

3.4 分子生物学检测

逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription PCR，简称RT-PCR)技术，具有检测速度快、灵明度高、特异性强的优势，已用于多种植物病毒的诊断与检测[18～20]。在果树病毒检测方面应用的分子生物技术主要包括核酸分杂交技术、多聚酶链式反应技术、双链RNA电泳技术、荧光定量PCR(real-time PCR)技术,又称实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技术等。有研究认为RT-qPCR技术检测灵敏度是ELISA检测的106倍[21]；尤其是一步法RT-qPCR的应用，具有更好的特异性[22]。这种方法可以适用于大样本病毒检测。

3.5 高通量测序技术

又称为下一代测序(Next Generation Sequencing NGS),是能够给予病毒入侵植物后产生的小干扰进行测序分析的技术方法，利用它能够发现新的病毒分子及其致病机理[23]。

4 苹果花叶病病毒种类检测及确定

苹果花叶病病原种类问题，随着植物病毒研究方法和技术不断提高，苹果花叶病毒鉴定技术也在不断改进和创新，对病毒种类得到进一步认识。从首次报道苹果花叶以来，人们普遍认为，引起花叶病的病原为单一苹果花叶病毒(Apple mosaic virus，ApMV)侵染所致，并且也做了大量的研究检测确认，如韩礼星(1991年)曾利用指示植物和血清学方法检测到苹果花叶病毒[24]，洪霓等(1994年)采用A蛋白酶联免疫法检测了苹果花叶病毒，并对血清学检测苹果花叶病毒进行探讨，随后，专家学者们将先进的分在生物技术应用到苹果花叶病的检测中[25]。杨俊玲于2004年，首次建立了苹果花叶病毒(ApMV)和李属矮缩病毒(PDV)RT—PCR检测体系,并优化了ApMV的RT—PCR监测体系，实现了高效低成本检测类[26]，候义龙等[27]和冀志蕊等[28]也分别研究建立了苹果花叶病毒RT-PCR检测技术。

也有一些专家学者认为引起苹果花叶病的毒原是李属坏死环斑病毒(Prunus nicrotic ringspot apple mosaic strain virus，PNRSV)中的苹果花叶株系[6,7]。另外，邱强曾报道除苹果花叶病毒外，还有李属坏死环斑病毒中的苹果花叶株系，这种病毒在我国是否存在及分布情况，有待研究。2016年Hu et al.在中国首次报道了李属坏死环斑病毒(PNRSV)能够侵染苹果叶片，引起花叶病[29]，梁鹏博等研究也说明，李属坏死环斑病毒(PNRSV)可能会引起苹果花叶病[30]。

近年来，高通量测序技术在苹果花叶病病毒检测和鉴定中得到运用，检测出引起花叶病新的病原--苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)，它与ApMV和PNRSV亲缘关系较近，可能是引起我国苹果花叶病的病原[23,31～32]。国内外在苹果花叶病病叶中检测到苹果坏死花叶病毒(ApNMV)的报道也有一些[33～36]。有专家在山东枣庄海棠花叶病叶片中也检测出苹果坏死花叶病毒[37]。这些研究结果证实李属坏死环斑病毒和苹果坏死花叶病毒都是引起苹果花叶病的病原[38]。

综上所述，引起苹果花叶病的病原不是由单一花叶病毒引起，而是由不同病毒引起系统侵染病害。

5 苹果花叶病发病规律

Vibert于1863年正式报到苹果花叶病的发生，指出该病能够通过芽接传播，后来Blodgett(1923)[39]和Bradford(1933)[40]试验也证明苹果花叶病可借芽接和切接进行传播，这是最早证明能够通过嫁接传播的病毒病害之一。人们普遍认为病毒主要靠嫁接传播，无论砧木或接穗带毒，均可形成新的病株。苹果花叶病毒(ApMV)既不能够通过带毒的种子和花粉传播，也没有相关传播媒介被报道[41～42]。

李属坏死环斑病毒(PNRSV)的种子和花粉传毒机理研究较为透彻。PNRSV入侵花粉粒，感染胚囊和生殖细胞，减少花粉粒萌发，延迟花粉管的生长[43～44]。PNRSV在种子发育的早期就能够侵染包括胚在内的种子的所有部分。进行感染PNRSV杏果实的种子萌发试验发现，10%的感病种子能够完成PNRSV的侵染过程，部分幼苗表现严重的萎缩现象[45]。

嫁接后的潜育期长短不一，一般在3～27个月之间，气温10～20℃时，光照较强，土壤干旱及树势衰弱时，有利于症状表现。幼苗接种后，潜育期一般较短。

苹果花叶病症状表现，在苹果萌芽后10～20 d表现出来，在幼果期(花后20～30 d)发展迅速，其后急剧减缓。7～8月盛夏期，病害基本停止发展，甚至出现症状隐蔽现象。9月初病树抽发秋稍后，症状又重新开始发展，10月份又急剧减缓，11月份完全停止。

6 苹果花叶病防治方法

6.1 选用无病毒接穗和砧木

栽培无病毒苗木，是防治苹果花叶病毒的根本措施[3,6～9，46～47]。但是由于无毒苗木繁殖程序复杂，技术水平要求高，环境条件要求严格，价格贵，在生产上应用很少，大面积推广也较为困难。因此，在繁育苗木是，严格选用无病毒接穗和砧木是简单实用的最有效的办法[48～50]。

6.2 使用有效药剂，是控制病害的发生发展最有效的方法

在生产中，要加强管理，增强树势，提高抗病能力；对于严重的病枝要剪除或严重的病苗要拔掉，这些对预防和减少花叶病的发生有重要作用。对已经挂果的果园，使用有效药剂，是控制病害的发生发展最有效的方法。许多专家使用化学农药也进行了大量研究，如春季发病初期，可试喷洒1.5%植病灵乳剂1 000倍液或83增抗剂100倍液，20%盐酸.吗林胍.铜可湿性粉剂(毒克星，原名病毒A)4 000倍液，隔10～15 d喷1次，连续2～3次,可有效防治花叶病。 用20%吗胍.乙酸铜灌根，在3月20日～4月20日防治苹果花叶病效果可达约98%以上[8,51～52]。赵小明等用寡聚半乳糖醛酸300倍～500倍喷雾，防效达87%,81%～92.08%[53]。吕开伟等采用放射沟根施施果多防治苹果花叶病田间试验，防治效果达75%，既能增产又能提早成熟期[54]。杨鸳研究表明，6%阿泰灵(寡糖.链蛋白)1 000倍液、10%病毒唑1 500倍液和2%吗啉胍.铜1 000倍液对花叶病都有防治效果，并且用6%阿泰灵输液滴干技术，不仅可以防治花叶病，还可以提高果实品质[55]。

7 展望

7.1 利用生物农药及复配剂防控需要试验

苹果花叶病因为发病较慢，常不被人重视。随着病害越来越重，尽管在防治上已取得了一定进展，但是生物农药、生物农药与生长调节剂(如芸苔素)复配在防治苹果花叶病方面报道还很少，随着药肥双减在生产中的实施进展，迫切需要不断研究新的生物农药及复配剂防效试验。

7.2 实生苗花叶病病原需要鉴定

专家学者研究认为，苹果花叶病毒(ApMV)既不能够通过带毒的种子和花粉传播，也没有相关传播媒介被报道[41～42]。但国内外都曾在实生苗圃里见到花叶病株，根据在一些地区调查(1977年)看到不少海棠实生苗中有花叶病株，可见种子传染花叶病毒的可能性是很大的[6,8]。这是由李属坏死环斑病毒侵染种子引起，还是由最新发现的苹果坏死花叶病毒侵染种子引起，目前尚无确切的试验证明， 有待于进一步研究。另外，关于新发现的苹果坏死花叶病毒致病机理和传播途径，文献报到较少。

7.3 新品种对花叶病抗性需要研究

锦绣海棠由于结果早、丰产，风味美，成熟早，是集观赏和鲜食为一体的优良品种，深受人们的青睐，近年来，作为矮化密植新建果园优良的授粉树或观光园的主栽品种，面积在不断扩大。经过在延安富士和锦绣海棠在同一块地或同一个果园中调查观察，红富士苹果树或轻或重都有花叶病，而锦绣海棠却没有见到花叶病，是否锦绣海棠较抗苹果花叶病，有待研究。