乳腺癌干细胞在乳腺癌发生发展中的作用*

李晓梅，罗 清

遵义医科大学附属医院肿瘤研究室，遵义 563003

目前针对乳腺癌的早期监测及治疗体系日趋成熟，但乳腺癌患者的死亡率仍然位居女性恶性肿瘤死亡率的首位。复发与转移是引起乳腺癌患者死亡率升高的主要原因。随着研究的深入，人们发现乳腺癌的复发和转移与肿瘤内存在一群数量极少，但有肿瘤起始能力的肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)密切相关[1]，CSCs较多的乳腺癌患者生存率普遍较低[2]。更重要的是，CSCs可引起患者对现有治疗方法的耐药，导致乳腺癌患者面临“少药”甚至“无药”的难题[3]。鉴于CSCs在乳腺癌复发、转移、耐药中具有重要的作用，进一步认识CSCs并开发靶向CSCs的治疗药物对乳腺癌治疗具有重要的临床意义。本文对乳腺癌干细胞在乳腺癌复发、转移、耐药以及治疗方面的最新研究进行了总结，旨在为消灭乳腺癌干细胞，抑制乳腺肿瘤发生、发展提供依据。

1 乳腺癌干细胞的分离和鉴定

乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSCs)是乳腺癌肿瘤内极少数具有自我更新与多向分化能力的干细胞亚群，它的分离和鉴定是基于独特的细胞表面标志物，目前公认且最常用的是CD44/CD24和乙醛脱氢酶1(ALDH1)。CD44+CD24-和(或)ALDH1+细胞构成的乳腺癌干细胞样群体，可以通过流式细胞仪[4]、免疫磁珠[5]以及无血清微球体悬浮培养[6]等方式富集。在乳腺癌组织的原代培养细胞中CD44+CD24-、ALDH1+、CD44+CD24-ALDH1+细胞比例分别为7.2%、4.6%、1.5%，其自我更新、增殖、侵袭及成瘤能力依次由弱至强[7]。此外，以CD44+CD24-为特征的间充质样BCSCs主要是静止的，定位于肿瘤浸润前端，而上皮样BCSCs表达ALDH，具有增生性，且位于更中心位置[8]。可用流式细胞仪对分选和富集的细胞进行鉴定与CSCs阳性率的统计[9]，用于下游功能研究。

2 乳腺癌干细胞对乳腺癌发生发展的影响

2.1 乳腺癌干细胞与乳腺癌复发

复发是指肿瘤经过放化疗或手术等治疗后肿瘤再次出现的现象。尽管乳腺癌的治疗取得了突飞猛进的进展，但乳腺癌的复发转移率仍然高达23.4%，其原因与BCSCs密切相关[10-12]。常规的放化疗只能针对增殖活跃的BCSCs，但对静息状态BCSCs无杀灭作用。因此可能不足以完全根除BCSCs，而残留的BCSCs在被适当的信号激活后往往会引起肿瘤复发。

BCSCs可在某些转录因子以及炎症因子刺激下促进乳腺癌的复发。Hong等[13]研究表明，转录因子RUNX1通过抑制BCSCs活性以及直接下调ZEB1转录因子的表达，抑制小鼠乳腺脂肪垫内肿瘤细胞的生长。另外，慢性炎症在乳腺癌复发的发展中起着至关重要的作用[14]。Segatto等[15]发现乳腺癌患者手术后伤口排出的液体富含细胞因子和生长因子，它们可通过STAT3信号通路诱导具有干细胞样表型的BCSCs富集，进而引起术后肿瘤的复发。

近年来研究也表明BCSCs参与乳腺癌复发往往离不开一些信号通路的调控。Baker等[16]发现，乳腺癌患者经长期曲妥珠单抗治疗后，乳腺癌耐药株中BCSCs数量明显增多，这一结果是通过Notch-1-PTEN-ERK1/2信号通路的激活导致的。其研究显示，当敲除Notch-1基因后，BCSCs成球能力随之降低，而这种效应在敲除PTEN基因时，被一定程度的抑制。进一步实验发现MEK1/2抑制剂可完全抑制转染Notch-1、PTEN或Notch-1和PTEN siRNA细胞的成球能力，表明Notch-1通过PTEN抑制使ERK1/2过度激活，进一步激活体内外BCSCs，导致肿瘤复发[16]。另外，Wnt信号通路与BCSCs介导的乳腺癌复发有关。Choi等[17]发现，CSCs调节因子CDK12的高表达可激活Wnt或ErbB-PI3K-AKT信号通路，进而诱导BCSCs的自我更新和激活肿瘤形成能力，导致乳腺癌的复发。

2.2 乳腺癌干细胞与乳腺癌转移

转移是恶性肿瘤的标志，也是导致乳腺癌患者及其他癌症患者死亡的主要原因之一[18]。BCSCs可能是肿瘤侵袭转移的基础，当特殊的干性标志物高表达或在肿瘤微环境(趋化因子、转录因子以及蛋白)作用下可促进乳腺癌的转移。

CD44和ALDH的表达与乳腺癌的转移正相关。研究表明，在异种移植模型中，来自肺转移的乳腺癌肿瘤细胞CD44表达明显升高，且与ALDH-细胞相比，ALDH+细胞具有更高的转移能力。此外，CD44+CD24-细胞的数量与远处转移也显著相关。研究表明，有淋巴结转移的三阴性乳腺癌患者中有69.0%检测到CD44+CD24-表型，而无淋巴结转移的三阴性乳腺癌患者中有51.7%检测到CD44+CD24-[19-20]。同样，与非转移性乳腺癌组织相比，转移性乳腺癌组织中CD44高表达，而CD24的表达水平较低[21]。可见，BCSCs可能是肿瘤侵袭转移的基础，当CD44和ALDH等干性标志物高表达时，可促进乳腺癌的转移。

此外，BCSCs在一些特定的肿瘤微环境作用下可发生上皮-间质转化(EMT)，这一转变使BCSCs获得某些特性从而促进了乳腺癌的转移。在肿瘤微环境中，TGF-β信号转导是促进肿瘤细胞EMT与侵袭迁移的主要诱因[22-23]。Katsuno等[24]发现，BCSCs生成和治疗抗性的增加，与TGF-β促进乳腺上皮和癌细胞中稳定的EMT有关。相反，抑制TGF-β能抑制巨噬细胞诱导的乳腺癌细胞EMT和BCSCs形成；从而降低乳腺癌肺转移[25]。

值得注意的是，BCSCs发生增殖与转移也可直接由某些趋化因子、转录因子及蛋白调控。研究显示，在BCSCs亚群中趋化因子受体CXCR3B明显上调，异位表达CXCR3B可增加ALDH活性或CD44+CD24-的BCSCs数量，并增加细胞克隆形成能力，促进癌细胞的迁移与侵袭[26]。此外，Sirkisoon等[27]研究显示，BCSCs中CD44、Nanog、Sox2和OCT4等干性基因可被转录因子TGLI1转录激活，导致BCSCs的更新，促进转移起始部位BCSCs发生脑转移。另有研究发现，休眠BCSCs在自噬相关蛋白7(ATG7)、ATG3或p62/sequestosome-1低表达时，调控BCSCs中6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3异常表达，从而导致增殖程序和转移性生长的重新激活，促进乳腺癌转移[28]。

2.3 乳腺癌干细胞与乳腺癌耐药

耐药仍然是癌症治疗中的持续挑战，常常导致抗癌疗效的减低。BCSCs本身对新辅助化疗具有内在抗性[29]。研究发现，高表达ALDHs或CD44细胞群的乳腺癌患者对化疗具有更高的耐受性，因为该细胞具有BCSCs的特征，对常规化疗具有耐药性[30]。Ryoo等[31]发现，高表达CD44导致CD44+的BCSCs中p62相关的NRF2激活，进一步促进了CD44+BCSCs的耐药。ALDH1活性的增加与介导多药耐药相关，抑制ALDH1能增加乳腺癌患者对紫杉醇的敏感性[32]。同样，ALDH1+的BCSCs在化疗药物顺铂治疗抵抗中也起重要作用，当减少ALDH+的BCSCs时，顺铂的化疗效果显著增强[33]。此外，BCSCs中ABC家族转运蛋白的表达增高可能会导致肿瘤的多药耐药[34]。研究发现，与正常组织相比，乳腺癌组织中ABCC1与ABCC3转录水平较高；并且在化疗或抗癌药物治疗后两种蛋白的转录水平进一步增加，当将ABCC1或ABCC3两个蛋白敲除后，BCSCs干性基因的表达降低，化疗敏感性明显增加。而ABCC3敲除还降低了CD44+CD24-的BCSCs亚群，增加了异种移植小鼠模型体内阿霉素的敏感性。ABCG2转运蛋白基因的高表达可将治疗药物从细胞中外排，导致BCSCs治疗抵抗，通过抑制ABCG2可促进BCSCs死亡，减少治疗耐药[35]。可见，BCSCs中ABC家族转运蛋白的表达增高会导致肿瘤治疗的多药耐药，反之，抑制BCSCs中ABC家族转运蛋白的表达可减少治疗肿瘤时多药耐药的发生。

长期以来，活性氧(ROS)的产生一直被认为是化疗耐药的重要介质。近年来研究发现，BCSCs可能通过增强ROS促进乳腺癌患者的耐药[36]。Yang等[33]研究发现，ALDH+的BCSCs和ALDH-的癌细胞具有不同水平的ROS，通过调节细胞内ROS的生成可增加顺铂的化疗敏感性。同样，Lee等[37]发现化疗后，BCSCs中MYC和MCL1过表达，MYC和MCL1可促进线粒体氧化磷酸化产生ROS，导致BCSCs耐药性增加。

3 乳腺癌干细胞的靶向治疗策略

BCSCs在介导乳腺癌复发、转移以及化疗耐药中具有关键作用，目前BCSCs靶向治疗策略主要有：细胞靶向治疗、基因靶向治疗以及纳米靶向治疗等。靶向清除BCSCs可能是克服乳腺癌患者治疗失败和提高患者预后的有效策略。

例如，在细胞靶向治疗中，间充质干细胞(MSCs)已成为一种有前景的靶向CSCs治疗剂[38]。Mandal等[39]使用海藻酸钠将围产期组织沃顿胶(WJMSCs)中的MSCs封装到微珠中，以研究其对BCSCs的影响。结果显示，用封装的WJMSCs(eWJMSCs)处理BCSCs降低了细胞活力，抑制迁移并发挥抗血管生成作用。进一步基因表达分析结果显示，eWJMSCs能抑制BCSCs增殖标志物、药物转运蛋白、EMT相关标志物和血管生成相关基因的表达。此外，研究也发现长链非编码RNA(lncRNA)和microRNA(miRNA)可调控CSCs增殖，在靶向恶性肿瘤治疗中具有重要的应用价值[40-42]。lncRNA CCAT2通过促进OCT4、Nanog和KLF4等干细胞标志物的表达，增加乳腺球的形成，诱导三阴性乳腺癌中ALDH+BCSCs数量[43]。miR-205在CD44+CD24-的BCSCs中低表达，过表达miR-205可降低乳腺癌细胞中CD44+CD24-群百分比与细胞活性[44]。在HER2+乳腺癌中，miR-200c的高表达可导致CD44+CD24-的BCSCs细胞数量明显减少[45]。分析BCSCs和患者转移性肿瘤组织发现，在BCSCs中miR-200c的表达水平降低，而miR-30c的表达水平升高，这与接受新辅助治疗的Ⅱ/Ⅲ期患者中分离出的乳腺肿瘤组织表达水平相似[46]。因此，针对miRNA可能有助于开发靶向BCSCs的治疗药物。

近期一种靶向BCSCs的方法应用分子导向纳米技术有效地控制药物输送和释放，不但提高了CSCs对药物的吸收，而且增加了药物在细胞内的停留和释放。Das等[47]研究发现，Wedelolactone-encapsulated纳米可通过下调Sox2和ABCG2增强药物的停留。此外，它能阻止EMT，抑制细胞迁移和侵袭，降低BCSCs比例,抑制肿瘤生长与转移。当它与紫杉醇联合应用时，可增加紫杉醇化疗敏感性，降低ALDH+BCSCs比例。用载于纳米金蛋白冠上的SAHA/Wnt-b Catenin拮抗剂能靶向BCSCs，抑制BCSCs数量[48]。此外，使用靶向干细胞标志物CD133的RNA纳米颗粒递送抗miRNA[49]，以及载有偶联的DNA纳米序列TA6NT-AKTin-DOX均对BCSCs治疗具有靶向性[50]。因此，靶向纳米技术治疗可为清除BCSCs提供一种有效的药物传递途径。

值得注意的是，随着系统生物学与分子生物的革命性进展，生物信息学与“组学”在研究肿瘤特性方面的作用越来越显著，这将对BCSCs靶向治疗提供重要的思路[51-52]。富集BCSCs，对细胞进行单细胞RNA测序，可研究BCSCs向多分化的细胞状态转变过程，并在人群BCSCs中筛选调控的差异基因[53]。另外，Cheng等[54]利用Hydro-Seq追踪了21例乳腺癌患者组织中BCSCs的表达以及EMT标记的单个细胞，可见，基于“组学”平台的最新研究可识别与筛选BCSCs耐药性和转移相关的不同细胞群、靶点以及基因，开启了理解BCSCs的新视角，这对靶向BCSCs治疗的研究尤为重要。

4 小结

乳腺癌是一种在世界范围内女性中具有较高发病率和死亡率的肿瘤性疾病。尽管乳腺癌治疗取得了长足的进步，但是由BCSCs引起的复发、转移及耐药仍然是目前治疗所面临的最大挑战。因此寻求靶向BCSCs的治疗策略对于乳腺癌治疗显得尤为关键。通过总结BCSCs在复发、转移及耐药中的研究，以及部分靶向BCSCs的主要策略，我们可以展望：①在大多数情况下，治疗期间的活检很难实施，因此必须开发新的策略来检测BCSCs标记；②基于液体活检中的癌症标志物的发现，在血液/血清中鉴定BCSCs标记对于开发个性化BCSCs治疗可能更有效，也对乳腺癌的早期诊断及治疗有重要价值；③多种靶向治疗策略联合：生物信息学与“组学”基于“疾病-基因-靶标-药物”的相互作用，与小分子靶向药物“多成分、多靶点、多途径”的特点不谋而合，这将为开发靶向BCSCs的小分子药物提供新视角；④将全基因组转录分析转化为药物发现，从而在将来获得更好的治疗效果。因此，对BCSCs更为系统全面的认识，必将有助于提高乳腺癌的临床治愈率。