壳聚糖对葡萄病害和果实品质影响的研究进展

杨桂兰，陈迎春，昝林生，亓桂梅，王珊

（1. 山东省葡萄研究院，济南 250100；2. 德州学院，德州 253001）

葡萄作为浆果类水果，生产栽培中使用农药在所难免。近年来，随着社会进步和生活水平的提高，人们对食品安全的要求愈发强烈。因此，寻求天然的抗菌物质作为农药的替代品成为重要研究方向。壳聚糖（Chitosan）作为真菌、细菌和病毒的杀菌剂和植物防御机制的诱导子[1-2]，逐渐成为人们关注和研究的热点。

壳聚糖是由昆虫、甲壳类动物的外骨骼和真菌细胞壁中的几丁质（Chitin）通过去乙酰化而产生，其化学名称为(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖。在自然界中，壳聚糖的原料非常丰富，仅次于纤维素。因此，壳聚糖在农业生产中的应用经济可行。1979年，Allan等[3]发现，真菌细胞壁成分能够激活植物内在免疫系统，有利于减缓病害的蔓延。这项工作被认为是一项开拓性的研究，为真菌细胞壁成分的衍生物——壳聚糖在农业上的应用开辟了新领域。壳聚糖具有安全无毒、可降解等特性，已经成为最受欢迎的生物高分子物质和主要的植物诱导子。壳聚糖也是第一个被欧盟批准用于植物保护、有机农业和病虫害综合治理的基本物质（欧盟2014/563）。

壳聚糖在许多园艺作物中的应用潜力多有研究，包括诱导防御反应、改善农艺性状、果蔬采后管理、促进植物生长和增强生理活性等。近年来，有关壳聚糖在葡萄中应用的研究也越来越多，主要集中在病害防治、品质改善以及采后保鲜等方面。本文从葡萄病害防治和品质改善两个方面对壳聚糖在国内外研究和应用现状进行综述，旨在为壳聚糖和其他诱导子在葡萄中的深入研究提供参考。

1 壳聚糖在葡萄病害防治中的应用研究

壳聚糖活性可以归纳为两点，一是其聚阳离子结构[4]；二是其受体是一个78 kDa结合蛋白[5]。它能够在植物组织周围形成半透膜，抑制病原体生长，还能有效诱导植物的各种防御反应，如胼胝质和木质素的形成，合成病程相关蛋白以及几种防御酶（如苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶等）[6-8]。此外，壳聚糖还能促进植物抗毒素如二苯乙烯类[6,9]、白藜芦醇、ε-葡萄素和云杉新甙的产生，以及多酚类和萜烯类化合物的产生[2,7,10]。

1.1 壳聚糖与枝干病（Trunk Diseases，GTDs）

葡萄枝干病在世界上大部分葡萄产区均有发生，造成葡萄严重减产。据国际葡萄和葡萄酒组织（OIV）报道[11]，西班牙GTDs的发病率为10%，法国为13%，意大利为8%～19%，而加州每年因为GTDs的危害至少损失2.6亿美元。目前尚无有效的防治措施，GTDs在葡萄栽培上仍然是一大难题。

壳聚糖可以抑制GTDs相关真菌菌丝的生长，如葡萄座腔菌属（Botryosphaeria sp.）、拟茎点霉属（Phomopsis sp.）、侧弯孢壳属（Eutypa lata）、黑根病致病菌（Neonectria liriodendri）、厚孢小褐球壳菌（Phaeomoniella chlamydospora）和嗜蓝孢孔菌属（Fomitiporia sp.）真菌[12]。低聚壳聚糖以及与ε-聚赖氨酸、娄彻氏链霉菌、浅紫灰叶链霉菌次生代谢物形成的聚合物都可以抑制葡萄枝干病的致病菌如小新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）、色二孢属真菌（Diplodia seriata）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的生长[13]。Cobos等[14]研究发现，1 mg/mL的低聚壳聚糖处理对葡萄枝干病相关的葡萄座腔菌菌株CBS 113190、色二孢属真菌菌株CBS 112555、侧弯孢壳菌株CBS 101932、大双孢土赤壳（Ilyonectria macrodidyma）菌株CBS 120170、褐枝顶孢霉（Phaeoacremonium aleophilum）菌株CBS 631.94、厚孢小褐球壳菌菌株CBS 239.74和拟茎点霉菌株CBS 267.80的抑制率达到100%。

综上，壳聚糖抑制菌丝生长的效果与商业杀菌剂相当或者更好，所以它是一种有效防治葡萄枝干病的非常有潜力的候选物质[12-13]。

1.2 壳聚糖与灰霉病（Gray Mold)

灰霉病是葡萄的一种常见病害。葡萄从开花到采收，如遇雨水较多、空气潮湿、气候凉爽时极易引发灰霉病，给葡萄带来严重损失。人们通常使用化学杀菌剂来防治灰霉病的发生和蔓延。但长期反复使用化学杀菌剂，会使病菌产生抗药性。在葡萄贮藏期间也常有灰霉病发生，此时的防治更加困难。近年来，科学家们研究发现，壳聚糖能够有效抑制灰霉孢的生长，诱导葡萄对灰霉病的抗性，降低灰霉病的发病率。

Romanazzi等[15]研究发现，用不同浓度（0.1%、0.5%、1.0%）的壳聚糖溶液对鲜食葡萄进行处理，对灰霉病的防治效果显著。用壳聚糖溶液在采前21 d喷施鲜食葡萄果穗一次或采前21 d和5 d喷施两次，发现3种浓度的壳聚糖溶液均能降低葡萄采后灰霉病的发病率。用3种浓度的壳聚糖溶液分别浸泡成熟葡萄果实，并接种灰霉孢，处理后葡萄灰霉病的发病率、严重程度均有所降低。将单粒果实人为损伤，经壳聚糖处理并接种灰霉孢后，染病率和病斑直径均有所降低，且壳聚糖的浓度越高，防治效果越好。并且发现，1.0%壳聚糖处理可显著提高葡萄苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，因此认为壳聚糖能诱导葡萄对灰霉病的抗性。Muñoz等[16]用1.0～2.5 mg/L的壳聚糖溶液浸泡成熟葡萄果实，再接种灰葡萄孢，随后分别放在4 ℃和24 ℃下培养。结果发现，所有浓度的壳聚糖处理均能抑制灰霉孢的生长，其中2.5 mg/L的壳聚糖对菌丝生长的抑制率最高，达71.02%。Aziz等[17]采用不同分子量和乙酰化程度的壳聚糖对‘霞多丽’葡萄叶片进行处理，引发叶片中植物抗毒素、反式和顺式白藜芦醇及其衍生物ε-葡萄素和云杉新甙的积累。叶片在200 g/mL的壳聚糖溶液中浸泡48 h时，植物抗毒素的产量最高。高浓度的壳聚糖处理也能诱导葡萄叶片几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性。因此，不同浓度的壳聚糖处理均能显著诱导葡萄对灰霉病的抗性。在50 g/mL壳聚糖处理的叶片中，病变部分的直径比对照平均减少约50%；当壳聚糖浓度为100 g/mL及以上时，叶片病变部分的直径平均减少60%，这与Daphnée等的研究结果一致[18]。

1.3 壳聚糖与霜霉病（Downy Mildew）

葡萄霜霉病是由葡萄生单轴霉属（Plasmopara viticola）真菌引起的，是葡萄最严重的病害之一。在过去20年里，控制该病菌最广泛使用的方法是应用铜类杀菌剂，特别是在有机葡萄园中，铜类杀菌剂使用更多。铜类杀菌剂的大量使用导致铜在土壤表层迅速积累[19]。由于铜不能被土壤微生物代谢，只能通过淋洗逐步清除，导致土壤中步行虫和蚯蚓数量减少，引起土壤微生物数量和种群结构的改变以及酶活性的下降，降低土壤pH值，影响葡萄生长。因此，壳聚糖可以作为铜类杀菌剂的良好替代品。

Aziz等[17]采用200 mg/mL的壳聚糖溶液对‘霞多丽’葡萄进行处理，使霜霉病菌感染叶片比例从对照的42%降低到12%，感染率降低71%。Romanazzi[20]等研究发现，在低病压条件下，0.5%和0.8%壳聚糖处理的葡萄霜霉病发病率分别比对照降低56%和81%；在高病压条件下，0.5%和0.8%壳聚糖处理的葡萄霜霉病发病率分别比对照降低66%和75%。在所选择的几种铜类杀菌剂的替代品中，壳聚糖对霜霉病的防治效果最好。Daphnée等[18]用壳聚糖处理葡萄叶片，也发现壳聚糖能显著降低葡萄生单轴霉属真菌的产孢量。由此可见，壳聚糖对葡萄霜霉病有很好的防治效果，实际生产中可以替代铜类杀菌剂。

1.4 壳聚糖与白粉病（Powdery Mildew）

葡萄白粉病是由子囊菌亚门葡萄钩丝壳属真菌（Uncinula necator Schwein.）引起的，被公认为是影响葡萄产量和品质的一种主要疾病。当春季环境条件适宜时，在葡萄树体中越冬的闭囊壳产生子囊孢子，在葡萄园内传播，由分生孢子继发感染。病原菌寄生在植株绿色组织（叶子和浆果）的表皮层，对葡萄园造成严重损害，使葡萄产量和葡萄酒品质下降。

Gorbatenko等[21]在葡萄开花后用0.01%～0.1%的壳聚糖溶液进行第一次处理，14 d后第二次处理，发现壳聚糖降低白粉病的发病率。Iriti等[22]采用不同浓度的壳聚糖处理大田葡萄，发现0.1%的壳聚糖对白粉病的防治效果最好，病害严重度为2.39%，仅次于常规化学杀菌剂处理的0.92%，远好于未处理的87.5%。由此可见，壳聚糖对白粉病的防治效果与常规杀菌剂相当，但壳聚糖有安全无毒、可生物降解等优势，比常规杀菌剂具有更加广泛的应用前景。

1.5 壳聚糖与黑木病（Bois Noir）

葡萄黑木病是一种植原体病害，在大多数葡萄种植区广泛存在。在欧洲和地中海地区频繁爆发，并且已经传播到南非、西亚、澳大利亚、美州，可导致葡萄产量和品质大幅下降。目前还无有效措施来降低葡萄黑木病的发病率。Romanazzi等[23]从5月初到7月末，每周在感染黑木病的‘霞多丽’葡萄树冠上喷洒壳聚糖溶液，发现壳聚糖处理有利于染病植株的恢复，而且恢复后植株的定性和定量参数与健康植株没有区别。

1.6 壳聚糖与其他病害

壳聚糖除了能防治以上常见病害外，对葡萄的炭疽病和黑痘病也有一定的防治效果。Munoz等[24]研究发现，壳聚糖处理能显著降低常温下（24 ℃）葡萄浆果的炭疽菌（Colletotrichum spp.）菌斑的大小，但是对冷藏（4 ℃）条件下浆果的炭疽菌无显著影响。Prakongkha等[25]发现，壳聚糖可以使葡萄中水杨酸含量大幅度增加，诱导葡萄对痂圆孢属真菌（Sphaceloma ampelinum）的抗性，使葡萄黑痘病严重度降低75%。

此外，壳聚糖还能抑制葡萄采后其他病菌的生长。如Oliveira[26]等对采后葡萄应用壳聚糖涂层，发现能够有效抑制青霉菌菌丝生长和孢子萌发，使孢子发生形态学变化，并能有效保持葡萄物理、化学和感官等品质指标。Santos等[27]研究表明，联合应用壳聚糖和牛至精油涂层，可以抑制贮藏期间葡萄中黑根霉URM 3728和黑曲霉URM 5842孢子萌发，使孢子和菌丝发生形态学变化。

综上所述，壳聚糖在葡萄枝干病、灰霉病、霜霉病和白粉病以及黑木病等病害防治中都具有很好的效果。不但可以用于葡萄采前的病害防治中，而且对采后的病害防治也非常有效。

2 壳聚糖对葡萄品质影响

葡萄品质直接影响到葡萄酒的品质。有关葡萄品质的研究一直是国内外研究的热点。栽培方法，如整形、修剪和亏灌等都对改善葡萄品质有一定作用[28-31]。此外，人们也尝试使用诱导子，特别是壳聚糖，来改善葡萄浆果的品质。

2.1 总酚

酚类化合物是植物的次生代谢产物，能够保护植物免受紫外线、昆虫、病毒和病菌的侵害。酚类化合物存在于葡萄籽、果皮和果汁中，决定葡萄的色泽和风味，并具有很强的抗氧化能力，对人们健康有益，能够防止维生素流失和氧化损伤，还能抗癌、抗炎、抗过敏、抗高血压等[32]。近年来，科学家们就壳聚糖处理对葡萄酚类物质的影响展开研究。

Iriti等[22]采用壳聚糖处理‘蒙特布查诺’（Montepulciano）葡萄，发现处理后葡萄中的总酚含量显著提高。其中，0.1%壳聚糖处理的果皮中总酚含量提高19%，种子中提高22.5%。相反，常规杀菌剂处理的果皮中总酚含量降低19%，种子中降低10%。葡萄果肉也呈现类似的趋势。由此可见，与常规杀菌剂相比，壳聚糖在提高葡萄总酚方面具有显著优势。Singh等[8]用0.1%壳聚糖溶液在葡萄转色期和转色期后两次处理‘多瑞弗兰卡’（Touriga Franca）和‘猎狗’（Tinto Cão）葡萄，发现处理后两个品种果皮和种子的总酚含量均显著增加，其中，以处理后的‘多瑞弗兰卡’转色期果皮中增加幅度最大，达到29.51%。Silva等[33]用0.01%壳聚糖溶液处理‘索沙鸥’（Sousão）葡萄，处理后果皮中的总酚也有所增加。

但也有少数研究认为，壳聚糖对葡萄总酚的影响不显著。如Duxbury等[34]用壳聚糖处理‘赤霞珠’葡萄，结果发现壳聚糖对葡萄总酚没有影响。Portu等[35]发现，叶面施用0.03%壳聚糖溶液对‘丹魄’葡萄浆果的总酚几乎没有影响。由此可见，壳聚糖对总酚的影响因品种而异。

2.2 花色苷

花色苷是一种特殊的多酚类物质，影响浆果和葡萄酒的颜色。Singh等[8]对‘多瑞弗兰卡’和‘猎狗’葡萄的研究中发现，0.1%壳聚糖能使两品种果皮中总花色苷含量明显增加，在转色期分别增加35.27%和56.02%，转色期后分别增加17.42%和10.51%；完全成熟的‘猎狗’果皮中总花色苷也增加22.33%。Silva等[33]用0.01%壳聚糖溶液处理‘索沙鸥’葡萄，发现处理后葡萄果皮中总花色苷有所增加。Singh等[36]用0.01%的壳聚糖溶液处理‘猎狗’葡萄后发现，果皮中几种单体花色苷含量均显著增加，其中锦葵色素-3-乙酰葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素葡萄糖苷、锦葵色素-3-香豆酰葡萄糖苷增加较多，分别为82.45%、80.02%、75%和71.74%， 而芍药素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-香豆酰葡萄糖苷、锦葵色素3-葡萄糖苷、芍药素-3-香豆酰葡萄糖苷则分别增加56.72%、51.92%、50.87%和47%。此外，壳聚糖处理后的果皮中儿茶素、芦丁和槲皮素-3-O-半乳糖含量也显著增加，分别增加133.33%、105.85%和59.09%。而Romanazzi等[37]的研究结果与之相反，认为壳聚糖处理没有增加葡萄中儿茶素的浓度，而且降低芍药素-3-O-葡萄糖苷的浓度。Silva等[33]用0.01%壳聚糖溶液处理‘索沙鸥’葡萄，也发现芍药素-3-葡萄糖苷的浓度有所降低。

综上所述，壳聚糖处理对不同葡萄品种的总花色苷含量具有一定的影响。但是也有一些研究发现壳聚糖对葡萄总花色苷没有影响[34-36]，甚至在一些品种中应用壳聚糖对总花色苷有负作用，如壳聚糖处理的‘桑娇维赛’和‘赤霞珠’葡萄中总花色苷含量有所降低[38]。此外，Singh等[36]、Romanazzi等[37]和Silva等[33]的研究也表明，壳聚糖对各单体花色苷的影响不同。

2.3 单宁

单宁与葡萄的收敛性有关，和花色苷共同决定葡萄酒颜色的稳定性。Singh等[8]用0.1%壳聚糖溶液处理‘多瑞弗兰卡’和‘猎狗’两个葡萄品种，发现处理后的葡萄果皮和种子单宁含量均显著增加，其中转色期‘多瑞弗兰卡’的果皮和种子中总单宁含量分别增加14.18%和325.15%，‘猎狗’分别增加9.61%和9.23%；转色期后‘多瑞弗兰卡’分别增加37.48%和159.02%，‘猎狗’分别增加52.62%和21.32%；完全成熟时，‘多瑞弗兰卡’分别增加20.46%和32.12%，‘猎狗’分别增加48.46%和6.01%。与Singh等的结果相反，Silva等[33]用0.01%壳聚糖溶液处理‘索沙鸥’葡萄，结果显示，壳聚糖对总单宁含量有负面影响，导致葡萄果皮和种子中总单宁含量有所降低。

2.4 氨基酸

氨基酸是蛋白质的基本组成单位，是生命活动的物质基础。氨基酸含量及其组成特征是影响葡萄品质的重要指标。壳聚糖处理对于葡萄氨基酸含量具有一定的影响。

Tessarin等[38]用壳聚糖处理‘赤霞珠’葡萄，发现处理后葡萄总氨基酸含量有所升高，其中丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、γ-氨基丁酸、亮氨酸、异亮氨酸和丝氨酸含量较对照显著升高，其他氨基酸含量均有升高，但差异不显著。处理后的‘桑乔维赛’葡萄与对照相比，各种氨基酸和总氨基酸含量均升高，但差异不显著。而Gutierrez-Gamboa等[39]的研究结果与之相反，他们发现，‘丹魄’葡萄经壳聚糖处理后，许多氨基酸浓度有所降低，如谷氨酰胺降低24%，谷氨酸下降16%，γ-氨基丁酸下降27%，丙氨酸下降19%，丝氨酸下降19%，苏氨酸下降16%，赖氨酸下降39%，精氨酸下降25%，总氨基酸降低17%。Garde-Cerdan等[40]研究发现，壳聚糖处理使‘蒙特布查诺’葡萄中赖氨酸含量显著升高，其他氨基酸含量和总氨基酸含量显著降低。

综上所述，壳聚糖处理对葡萄总酚、花色苷、单宁以及氨基酸具有一定影响，但影响程度因品种而异。

3 应用前景及未来研究方向探讨

探索壳聚糖在可持续农业中的应用是世界范围内的一种趋势。目前关于壳聚糖的研究发展非常迅速，正处在从实验研究向实际应用逐渐转变的阶段。

壳聚糖处理对许多葡萄病害防治非常有效，这是一个不可否认的事实。而且因其使用技术简单，安全无毒，对环境友好，有着许多化学杀菌剂无可比拟的优点，未来极具发展潜力。但是不同葡萄品种施用壳聚糖的最适浓度、施用量、部位、时间和频率等都有待探索。壳聚糖虽然安全无毒，但是如果施用浓度过高，也会使植物产生中毒症状。如Crisp等[41]采用2.5 g/L的壳聚糖溶液处理温室中‘维欧尼’（Viognier）和‘赤霞珠’葡萄植株，使75%的叶片表现出严重的中毒症状，导致50%以上的叶片脱落。虽然壳聚糖对很多病害有效，但是如何提高壳聚糖对病害的防治效果还需要继续探索。Youssef等[42]用壳聚糖纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和壳聚糖-二氧化硅纳米复合材料处理‘意大利亚’（Italia）和‘红高’（Benitaka）葡萄。结果表明，3种材料在1%的浓度下均可减缓真菌生长，其中壳聚糖纳米颗粒可减少72%，二氧化硅纳米颗粒可减少7%，而壳聚糖-二氧化硅纳米复合材料可减少100%，并且未观察到3种纳米材料对葡萄品质的负作用。这说明壳聚糖和二氧化硅的纳米复合材料比壳聚糖单独处理更加有效。所以，壳聚糖与其他杀菌剂或者植物诱导子一起使用，可能会提高防治效果，这是一个非常值得研究的方向。

壳聚糖对葡萄中总酚、花色苷、单宁以及氨基酸具有一定影响，其影响程度因品种而异，所以壳聚糖对不同葡萄品种品质改善方面的作用还需要进一步地系统研究。有关壳聚糖改善葡萄品质的机理的研究比较少，Singh等[36]研究发现，壳聚糖处理能够使编码苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合成酶（CHS）、黄烷酮3-羟化酶（F3H）、花青素还原酶（ANR）、尿苷二磷酸葡糖:黄酮醇3-O-葡糖基转移酶（UFGT）、花青素转运蛋白（ABCC1和MATE1）和参与花色苷摄取到液泡的谷胱甘肽s-转移酶（GST）的靶基因表达增加，从而得出壳聚糖对酚类物质的影响可能通过改变编码次生代谢途径中许多关键酶和转运蛋白靶基因的表达而实现。壳聚糖对氨基酸含量影响的机理目前鲜有报道，还有待研究。

壳聚糖在葡萄病害防治和品质改善方面的作用不容小觑，在葡萄保鲜方面的应用研究也很多[43-45]。另外，壳聚糖还能促进葡萄植株生长，提高葡萄产量[46-47]。除此之外，壳聚糖在农业中的作用还有很多，比如，壳聚糖对黄瓜根结线虫具有良好的防效作用[48]，可保护多种植物免受苜蓿花叶病毒（ALMV）、烟草坏死病毒（TNV）、烟草花叶病毒（TMV）、花生矮化病毒（PSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯病毒X （PVX）的感染[49]，能够提高植物的抗旱性[50-51]。壳聚糖作为一种土壤改良剂对多种植物的枯萎病均有防治作用，它能够使疾病发展延迟，减少枯萎[52-53]，还能改善和活化土壤养分，增强多种土壤酶和根系酶活性，促进苹果幼树根系对土壤养分的吸收[54]。这些方面的研究在葡萄中还非常少，还有待进一步地探索。