2020 年度蜜蜂病毒学研究进展

贾 烁，邓 洁，陈功文，郑火青

（浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058）

2020 年收录于Web of Science 核心集的论文中，与蜜蜂病毒有关的研究成果共237 篇。研究论文大部分涉及2 种或更多种病毒，内容主要集中在流行病学和蜜蜂病毒与其他致病因子的协同作用。研究最多的病毒是残翅病毒（Deformed wing virus, DWV） 和囊状幼虫病毒（Sacbrood virus, SBV），与前2 年的研究热点一致。

Web of Science 收录的关于蜜蜂病毒的237篇论文中，主要作者来自37 个国家和地区，发表论文数量最多的国家为美国（59 篇），其次为中国（40 篇） 和德国（15 篇）。这些文章来源于114 种出版物，其中发表论文数大于5篇的分别是Viruses（21 篇）、Insects（14 篇）、Journal of Apicultural Research（9 篇）、Journal of Invertebrate Pathology（8 篇）、Scientific reports（8 篇）、PLoS One（7 篇） 和Frontiers in Microbiology（6 篇）。针对237 篇论文逐一分析排查，其中与蜜蜂病毒密切相关的研究性论文91 篇，综述论文4 篇，另有8 项专利申请。

本文结合研究方向和研究内容，有针对性地选择Web of Science 和中国知网中的部分文章进行综述，以期为国内蜜蜂病毒学研究和蜜蜂病毒病防控提供一定的参考。

1 病毒流行病学

1.1 流行病学调查

流行病学调查有利于研究者掌握病毒和其他病原体的流行情况和趋势，并及时采取措施降低病原体对蜂群的危害。通过对常见蜜蜂病原进行检测，Luis 等人首次报道了在古巴发现东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus, ABPV)、DWV 和SBV，且发现这些病原体在古巴已广泛流行[1]。在土耳其蜜蜂群中，DWV 是最流行的蜜蜂病毒，瓦螨和微孢子虫也能共同侵染蜂群，但所检测的样本中均未检测到克什米尔蜜蜂病毒(Kashmir bee virus, KBV)和小蜂螨，此外，多种病毒共同感染的情况较为普遍[2]。而土耳其东部地区的26 个意蜂蜂场中，DWV 和黑蜂王台病毒(Black queen cell virus, BQCV)的阳性率分别为69.23% （18/26） 和88.46%（23/26），ABPV 和慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus, CBPV)均为阴性，狄斯瓦螨（Varroa destructor） 的感染率为89%[3]。

2016 年美国加利福尼亚州的流行病学调查结果显示，DWV、BQCV、SBV 和西奈湖病毒（Lake Sinai virus, LSV） 是检出率较高的几种病毒，此外，蜂群健康与LSV2 丰度呈反比关系[4]。在斯洛文尼亚，意蜂LSV 的感染率（75.92%） 显著高于熊蜂的感染率（17.07%），并且鉴定出3 个不同的LSV 毒株，分别为LSV1、LSV2、LSV3[5]。

1.2 DWV 相关报道

DWV 是最常见的蜜蜂病毒，其与狄斯瓦螨的协同作用会降低蜂群的健康水平，缩短冬季蜜蜂的寿命[6,7]。之前有研究报道蜜蜂病毒能够感染蚂蚁，但是这些研究大多数都局限于一个本地蚂蚁种群。最新的研究使用DWV 和2种广泛入侵日本的蚂蚁（Paratrechina longicornis和Anoplolepis gracilipes） 来评估了亚太地区蚂蚁中蜜蜂病毒的流行病学和系统发育关系。在这2 种蚂蚁中都检测到了DWV，同种蚂蚁拥有相似的病毒感染状况，但不同种蚂蚁之间的地理分布模式和来源水平不同。此外，入侵性蚂蚁中检测到的DWV 在遗传学上与从亚洲的蜜蜂中分离到的DWV 相似，这表明入侵性蚂蚁对本地DWV 的富集可能很普遍，但DWV 对蚂蚁介导的本地节肢动物的传播效率可能因蚂蚁的种类而不同[8]。

De Souza 等（2020） 调查了南非DWV-A、DWV-B 和DWV-C 3 种基因型病毒的感染率及其病毒载量，并将研究结果与巴西、英国和美国最近的数据进行了比较，发现DWV- B是南非最普遍的基因型[9]；同时，DWV-B 也是比利时流行率最高的基因型，且瓦螨的寄生率与DWV-B 病毒载量之间存在显著的相关性，但大多数蜂群中DWV-B 仅以低或中等病毒载量存在[10]。而在智利的蜂场中，DWV-A的流行率最高（71%），DWV-B 的流行率很低，且未检测到DWV-C 基因型[11]；在阿根廷，DWV-A 的感染率超过90%，DWV-B 的感染率也达到了47%，并且在同一样本中测到了2 种基因型，但这2 种基因型能否重组以及可能带来哪些危害仍需进一步研究[12]。

2 病毒传播

病毒传播途径广泛，研究发现DWV-A 可以通过蜂产品进行传播。Schittny 等人针对该结论提出，在贸易条例中应考虑引入新病毒或毒株的风险评估，蜂产品的卫生证书中也应包括对病毒的分析[13]。

蜂王可以通过垂直传播途径将病毒传递给工蜂，所以普遍认为蜂王的健康状况可以代表蜂群中工蜂的患病概况，有研究者调查了工蜂和蜂王之间DWV 的传播关系，确认蜂王能将病毒传染给工蜂，但未发现从工蜂到蜂王的DWV 传播证据[14]。

蜜蜂病毒不仅能在蜜蜂群内广泛传播，同时也能侵染其他动物和昆虫。 例如，Gusachenko 等（2020） 证明了DWV 在熊蜂体内的复制，并发现熊蜂对DWV 某些侵染途径具有较强的抵抗力[15]。

Al Naggar 等（2020） 比较了BQCV 的水平传播方式（饲喂和注射） 对成年蜜蜂的影响，发现与喂食蜜蜂BQCV 相比，将BQCV直接注射到血淋巴中会导致更高的死亡率、更高的病毒滴度和RNAi 途径关键基因表达的显著变化[16]。

反向遗传系统可以用于研究病毒复制、传播和定位，也能更好地了解病毒的传播和致病机制。Gusachenko 等（2020） 证明了病毒在瓦螨体内的复制，还利用荧光蛋白修饰过的DWV 基因组直接观察病毒在注射的蛹或喂养的幼虫体内的分布，这些研究提供了对病毒复制动力学、传播和发病机制的了解，并提供了新的工具来研究DWV 介导的蜂群损失[15]。

3 病毒检测方法

蜜蜂病毒隐性感染情况很常见，大多数情况下仅依靠发病症状不能够获得准确的鉴定，因此基于免疫学方法以及病毒核酸检测技术进行蜜蜂病毒检测方法的开发始终是蜜蜂病毒学中的研究内容之一。Li 等以其实验室分离到的中华蜜蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV） CSBV 相关基因为基础，首先分别以Linker 连接的VP1、VP2 基因和连续编码VP2、VP4 和VP1 的整段基因为靶基因进行原核表达，并用纯化的表达蛋白来免疫小鼠和鸡。然后通过比较这2 个表达蛋白的抗原性，筛选出抗原性较好的蛋白代替CSBV 作为免疫原，制备单克隆抗体，并利用制备的单克隆抗体研制出了双抗体夹心ELISA 检测试剂盒。该试剂盒具有较高特异性、敏感性和准确性，可以用于CSBV 的临床检测，也为CSBV 的快速诊断和早期预警提供了技术支撑[17]。

同一内参基因在不同实验条件下的稳定性不同，因此选择最优的内参基因对蜜蜂基因表达的量化研究至关重要。Deng 等评估了11 个内参基因在3 种不同病毒感染和RNAi 条件下的表达情况。结果表明，在不同的病毒感染下， 应该选择不同的内参基因。 ache2、rps18、β-actin、 tbp 和tif 可用做检测蜜蜂感染以色列麻痹病毒（Israeli acute bee paralysis virus，IAPV） 时基因表达水平的内参基因，而actin 和tif 可用做检测蜜蜂感染CBPV 时基因表达水平的内参基因，rpl14、tif、 rpsa、ubc 和ache2 可用做检测中蜂幼虫感染CSBV时基因表达水平的内参基因， rpl14、 tif、rps18、ubc 和α-tubulin 可用做检测RNAi 处理下意蜂基因表达水平的内参基因[18]。

此外，关于蜜蜂病毒检测方法的研究进展还有很多。比如，Jin 等创建了一个具有感染性的CSBV 克隆，结合绿色荧光蛋白的表达，他们直观地观察到该克隆病毒可以感染中蜂和意蜂并在中蜂幼虫体内以口服接种的方式传播[19]。Kim 等介绍了应用qPCR 和DNA芯片技术来快速检测蜜蜂DWV 病毒[20]。Dittes等指出兽医诊断方法也可以在蜜蜂健康管理中发挥重要作用，讨论了该方法在成年蜜蜂病害检查中的应用，并重点介绍了ABPV、KBV、IAPV、CBPV 和DWV 以及狄斯瓦螨等混合感染的诊断和鉴别方法[21]。Cagirgan 等建立了一种多重RT-PCR 检测方法，能同时对7 种蜜蜂病毒（IAPV、SBV、DWV、ABPV、BQCV、KBV、CBPV） 进行快速检测，检测结果灵敏可靠、经济实惠[22]。

4 病毒与蜜蜂的互作机制

蜜蜂细胞系可以为研究蜜蜂病毒与其宿主之间相互作用的分子机制、抗病毒药物的开发等提供有利工具。为此，Guo 等系统综述了膜翅目昆虫细胞系的原代培养、建立连续细胞系以及建立无病毒细胞系的方法，并指出蜜蜂细胞系在昆虫病毒学中的潜在应用[23]。在缺乏可用的蜜蜂细胞系的情况下，探索蜜蜂病毒在其它物种细胞系中复制的能力，可以为在细胞水平上研究和了解病毒感染以及抗病毒药物的筛选等相关研究提供新的方法。为此，Erez 和Chejanovsky （2020） 使用鳞翅目血细胞细胞系(P1) 进 行DWV 的 感 染 研 究[24]。 结 果 表 明，DWV 在细胞体内复制，且基因组拷贝数在感染后增加。尽管从感染细胞中获得的病毒产量很低，但该研究首次证明DWV 可以在异种细胞系中复制。

尽管缺乏合适蜜蜂细胞系，对蜜蜂病毒致病机理的研究仍取得了颇多进展。Huang 等人通过酵母双杂交和免疫共沉淀发现DWV 的结构蛋白VP2 与宿主的热休克蛋白10 （Hsp10）存在互作关系，且当过表达DWV 的VP2 蛋白时，Hsp10 的表达量降低[25]。而McMenamin 等人的研究也发现与在恒温条件下的蜜蜂相比，热应激蜜蜂（即在42℃下生存4 h） 体内的模型病毒（Sindbis-GFP） 水平降低，且病毒感染和/ 或热休克导致了6 个热休克蛋白编码基因和3 个免疫基因发生差异表达[26]。上述结果表明包括热休克反应在内的应激反应途径可能在蜜蜂免疫和抗病毒作用中起着重要作用。

Deng 等采用mRNA 和SRNA 高通量测序方法，研究了中蜂幼虫在自然条件下感染CSBV 后的microRNAs 和siRNAs 的表达变化。他们发现，参与免疫反应的丝氨酸蛋白酶表达下调，而针对丝氨酸蛋白酶的siRNAs 表达上调。此外，CSBV 感染还影响了中蜂幼虫角质层蛋白A1A 和A3A 的表达，从而增加了中蜂幼虫对CSBV 感染的易感性。这项研究结果表明sRNA 可能参与调节蜜蜂的免疫反应[27]。

Li-Byarlay 等研究了在感染IAPV 后5 h、20 h 和48 h 时白眼蛹基因表达和DNA 甲基化的动态变化。结果表明，白眼蛹在感染IAPV 后20 h 和48 h 时比在5 h 时有更多的差异表达基因，但在感染IAPV 后5 h 时比20 h和48 h 时DNA 甲基化区域变化更显著[28]。

5 病毒与其他因子的协同作用

同时暴露于多种压力因素被认为是导致蜜蜂群体数量下降的主要原因，因此针对病毒与其他不利因素的协同作用对蜂群影响的研究一直是蜜蜂病毒学领域的热点。

5.1 蜜蜂病毒与蜂螨的协同作用

在巴布亚新几内亚（Papua New Guinea,PNG），雅氏瓦螨（Varroa jacobsoni） 已经通过宿主转移实现了在当地的意蜂中繁殖。在最初的蜂群损失后，养蜂人在没有使用杀螨药的情况下维持蜂群超过10 年，这表明这些蜜蜂种群有一种未知的螨虫耐受机制。研究人员利用高通量测序等方法，发现这些地区的意蜂、东方蜜蜂以及蜂螨中都未发现DWV 的感染，因此推测在无DWV 感染的情况下，意蜂对雅氏瓦螨可能具有较强的耐受性[11]。相对于雅氏瓦螨，狄斯瓦螨因其与DWV 的协同作用对蜂群造成的毁灭性危害而受到了更多关注。在实验室条件下，Gisder 等利用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization） 等方法在狄斯瓦螨细胞中发现了DWV 的信号，并且找到了DWV-B 感染肠上皮细胞和唾液腺的直接证据，但他们并未发现DWV-A 的感染[29]。而de Guzman 等对菲律宾巴拉望岛上的意蜂蜂蛹及其寄生虫小蜂螨（Tropilaelaps） 和狄斯瓦螨的流行病学调查结果也表明DWV-B 比DWV-A更流行，此外，无论是感染了哪种螨虫的蜂蛹，它们的DWV 的感染率都比未被螨虫感染的高[30]。这些结果表明了狄斯瓦螨不仅能够促进DWV 的传播，还会对DWV 的不同毒株产生相应的影响，从而可能导致致病性强的DWV-B 的流行。

狄斯瓦螨的广泛分布及其在蜂群中对病毒传播的促进作用也引发了学者们对由蜂螨带来的蜜蜂病毒流行对其他重要昆虫造成危害的担忧。由此，Brettell 等人通过转录组测序探究了在有瓦螨和无瓦螨存在时，意蜂、胡蜂、苍蝇和蚂蚁等的病毒谱的差异[31]。结果显示，虽然瓦螨与蜜蜂中DWV 的丰度显著增加有关，但在其他类群中没有发现这种变化。这表明在蜂群中由瓦螨流行而导致的病毒载量的增加可能并不会导致同域分布的其他昆虫体内病毒载量的上升。

5.2 蜜蜂病毒与农药的协同作用

新烟碱类杀虫剂是全球使用最广泛的杀虫剂，这些农药是通过影响昆虫中枢神经系统中的烟酰胺乙酰胆碱受体发挥作用的一种神经毒素。这类杀虫剂在农业上的广泛使用，被认为是造成授粉类昆虫尤其是蜜蜂数量下降的一个关键因素。常见的新烟碱类杀虫剂包括吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、噻虫胺等，但这些杀虫剂与蜜蜂病毒的协同作用对蜂群的可能影响仍未得到充分的阐述。2020 年发表的有关病毒与农药的协同作用的文章有4 篇，其中3 篇的研究对象为新烟碱类杀虫剂（噻虫嗪、噻虫胺） 与DWV 等病毒的协同作用，剩余1 篇则关注了2 种新型新烟碱类杀虫剂氟吡呋喃酮(flupyradifurone, FPF) 和氟啶虫胺腈(sulfoxaflor,SULF) 与DWV 的协同危害。上述研究表明噻虫嗪虽然不能引起成年蜜蜂体内DWV 载量的上升，但其与DWV 可能产生协同作用而诱导成年工蜂的早熟觅食，并且增加了工蜂第一次飞行后不返回蜂群的风险；噻虫胺对意蜂幼虫体内DWV 的复制不会产生显著的影响，但会促进成年意蜂工蜂体内DWV 滴度的上升。有关FPF 和SULF 的研究则发现，在实验室条件下它们对蜜蜂体内DWV 的复制不产生明显的影响，这表明接触这类新型杀虫剂并不会显著加剧病毒对宿主生存的影响[32-35]。

5.3 蜜蜂病毒与肠道菌群的相互作用

肠道菌群参与调控宿主的免疫反应、维生素的合成和食物的消化等。蜜蜂肠道菌群的稳态与其宿主的健康息息相关。Yongsawa 等给6日龄的中蜂幼虫和意蜂幼虫饲喂含有SBV 的蜂王浆24 h，检测了SBV 对中蜂幼虫和意蜂幼虫肠道菌群的影响。实验结果显示，中蜂幼虫感染SBV 后，其肠道菌群的破坏程度比意蜂幼虫更严重。 意蜂幼虫的核心菌种Gilliamella、 Snodgrassella 和Fructobacillus 的相对丰度都没有发生显著变化，而中蜂幼虫的核心菌种Gilliamella 的相对丰度从35.5%下降至2.96%，Snodgrassella 和Fructobacillus 反而显著增多。这表明感染SBV 病毒可以扰乱蜜蜂肠道菌群，改变肠道菌群的多样性，并进而通过肠道菌群紊乱影响健康[36]。

6 抗病毒方法的开发

植物化学物质是蜜蜂经常接触的一类物质，其中许多已被证明可以改善蜜蜂的健康。Edward 等人测试了香芹酚、百里香酚、对香豆酸、槲皮素和咖啡因对人工接种了IAPV 的蜜蜂的影响，发现咖啡因是唯一能够显著提高蜜蜂存活率的物质[37]。同时，另一团队的研究也表明咖啡因能促进免疫相关基因的表达，降低蜜蜂体内DWV 病毒拷贝数[38]。这些结果表明咖啡因有可能帮助蜜蜂对抗病毒感染。而关于另一种自然界中常见的化学物质——苦杏仁苷的研究则表明饲喂该物质能使蜂群水平上的BQCV、CBPV 和DWV 滴度下降，但会导致SBV 滴度上升[39]。除了一些常见的植物化学物质，在蜜蜂饲料中添加某些能增强蜜蜂免疫力的膳食补充剂也可能是一个预防和治疗蜜蜂病毒病的有效途径。Antonio 等发现，1,3-1,6β-葡聚糖的摄入不仅能够提高蜜蜂的存活率，还能降低蜜蜂体内DWV 的滴度[40]。

Fei 等发现DWV 的表面衣壳蛋白可作为开发针对该病毒的治疗性抗体。他们对DWV表面衣壳蛋白基因的VP1、VP2 和VP3 密码子进行了优化，并将优化后的基因在大肠杆菌中进行了表达和纯化。然后，将免疫小鼠的抗roVP- 抗血清分别与DWV 共同孵育，并注射到健康白眼蛹内。结果发现，接种96 h 后，与单纯病毒组相比，重组蛋白（roVP1、roVP2和roVP3） 的特异性抗体可以显著性降低白眼蛹中的DWV 病毒滴度[41]。

肠道菌群与其宿主的健康和免疫有着密切的联系，是宿主正常发育和健康生活不可或缺的参与者。Leonard 等发现将含有目的基因的质粒导入蜜蜂肠道内β- 变形纲的一种核心菌种Snodgrassella alvi 内，这种经过基因编辑后的细菌重新定殖回蜜蜂肠道后能够连续生产dsRNA 来诱导蜜蜂的RNAi 反应，抑制蜜蜂体内DWV 的复制。同时，当狄斯瓦螨寄生蜜蜂时，它们以蜜蜂脂肪体为食，并摄取存在于该组织中的dsRNA，从而触发自身的RNAi 反应，进而保护蜜蜂免受蜂螨的侵袭，减少蜜蜂体内DWV 的复制，提高蜜蜂的存活率。该研究创新性地提出通过经基因编辑后的蜜蜂肠道细菌可以抑制蜜蜂体内DWV 复制和杀蜂螨，提供了一种高效的抵抗病毒和蜂螨的方法，也为后续有关肠道菌群与病毒感染相关的研究提供了一种新思路[42]。

7 蜜蜂病毒相关的专利

与蜜蜂病毒相关的专利共有8 项，其中针对CSBV 的专利有4 项， IAPV 的有2 项，BPV 的有1 项，另外1 项专利与蜜蜂多种病毒相关。侯春生等提出丹桂、八月桂和人参花的提取物可以有效预防蜜蜂感染蜜蜂麻痹病毒。孙丽萍等提出香豆素、腺苷、脯氨酸和含有板蓝根、黄樟叶、蜂胶的中药组合物可用于制备防治CSBV 感染的药物或饲料，能够显著提高感染CSBV 的中蜂幼虫的存活率，降低病毒的拷贝数，同时还能够诱导内源性抗菌肽的表达，提高蜜蜂的免疫力。张体银等发明了一种蜜蜂IAPV 实时荧光RT-PCR 检测试剂盒及其使用方法。