基于动态荧光指数的草莓干旱胁迫分析

景敏，马祯元，杨帆，张琦，丁敏，陈曼龙

(1. 陕西理工大学机械工程学院，陕西 汉中 723000； 2. 陕西省工业自动化重点实验室，陕西 汉中 723000)

水是植物体的重要组成部分，参与了植物的蒸腾、呼吸、光合作用等生理反应过程.水分含量影响植物的结构形态和生长发育，关系着农产品效能产出及经济转化比率.传统的水分含量监测方法大多响应速度慢、精度低且直接接触会破坏植株生长[1].近年来，随着各种新型无损检测仪器研发及光学技术的发展，荧光检测及成像技术已经逐渐开始大范围应用在农业生产领域[2-4].叶绿素荧光诱导技术主要分为主动和被动2种方法，作为最大的被动遥感辐射源，基于日光诱导的叶绿素荧光分析技术在遥感领域最为常见[5-7]；主动诱导荧光技术则是利用激发光源激发叶绿素分子产生荧光，通过信号处理和光电转换的方法获得荧光信息.由于这一过程与光合作用竞争，因此可以通过叶绿素荧光传感来探测植物光化学的效率[8]及不同因素对光合作用的影响[9],相当于光合作用指示器，从而广泛应用于植物各类胁迫状态的监测和预警.

叶绿素是一种优良的荧光发射器.荧光测定技术可以不破坏细胞，不伤害生物体，在生物学和农业领域常被用于分析微量元素胁迫和检验植物样品.王艺斐等[10]通过测定光合色素含量、吸收光谱和叶绿素荧光参数, 讨论了叶片黄化和脱落的关系.杨一璐等[11]利用荧光叶片图像对辣椒的氮含量进行了建模预测.王迎旭等[12]利用叶绿素荧光成像系统研究了黄瓜植株不同病害区分及早期病害监测的可行性，证明了此方法具有良好的应用前景.DONG等[13]利用叶绿素成像技术分析了不同等级的冷害胁迫对番茄幼苗的影响.OSRIO等[14]利用叶绿素荧光成像技术研究了Fe元素对草莓光合作用的影响；PRADHAN等[15]通过测定叶绿素a荧光参数，研究了盐胁迫和部分水分胁迫对水稻光合性能的综合影响.除此之外，荧光技术还广泛应用在遥感监测识别[16-17]等领域.

传统荧光诱导技术多利用荧光动力学曲线进行光化学效率及光化学淬灭系数分析[18]，其中荧光快相反应部分在数秒内完成,检测仪价格昂贵且批量测量操作不便.由于植物内部因素影响，同胁迫下植物二维空间表现不同，而便携式荧光仪等商用仪器难以大面积表征叶面受迫二维反应.

文中利用叶绿素荧光成像系统对草莓幼苗进行叶绿素荧光成像，采集并提取叶绿素荧光图像参数，利用图像灰度时间序列绘制荧光淬灭曲线，建立叶绿素荧光参数、动态荧光指数与干旱胁迫天数的相关模型，以实现草莓幼苗干旱胁迫监测，同时结合图像分析均匀光照下荧光图像受迫二维表现的差异性，为干旱环境对草莓的生长影响研究提供一定的理论基础.

1 材料和方法

供试草莓品种为“久香”草莓.选20株长势一致且约为4片真叶的草莓幼苗进行培育，植株高度为70～100 mm.

对草莓幼苗进行离体和活体干旱胁迫试验.离体试验是指采集草莓幼苗离体叶片荧光图像，观察叶绿素荧光图像变化及部分荧光参数与胁迫时间的相关性.在试验时采摘表面平整且无损伤的草莓叶片，经过20 min暗处理后进行荧光图像采集.活体干旱胁迫试验较为复杂，需要对草莓幼苗提前进行组别培育处理.将草莓幼苗随机分为2组A和B，每组10株，剔除异常品种后进行分组培育.其中A组不浇水为试验组，B组每日浇水20 mL作对照组，连续7 d每隔24 h对其进行荧光图像采集，观察叶绿素荧光图像参数变化规律.

2 试验与分析

为获得清晰易于处理的荧光图像，设计了如图1所示的叶绿素荧光成像采集系统[19].采用大功率集成LED阵列作为激励光源，LED通过散热基座与恒流源相连，确保散热及持续工作.图像采集装置选用维视MV-EM120/C CCD相机，镜头前安装有峰值680 nm半带宽15 nm的带通滤光片.为避免环境光的干扰，整个试验在暗室中进行.

图1 荧光成像系统示意图

2.1 图像预处理

图像预处理的主要目的是消除图像的无关信息，增强真实信息及相关信息的可检测性和最大限度简化数据，从而改进后续提取处理的可靠性.由于CCD成像设备及冗余环境噪声的影响，为了更好地分析叶片区域的图像特征，在进行数据处理前需要对采集到的叶绿素荧光图像进行去背景操作.文中采用最大类间方差法(OTSU)进行阈值分割然后与原图相乘进行去背景，能有效减免干旱胁迫试验过程中植株和设备移动及多次拍摄带来的不可量误差.去背景流程如图2所示.

图2 去背景流程图

图3为草莓叶片预处理图像.从左至右依次为草莓荧光叶片原图、OTSU法进行阈值分割处理生成二值化图像以及去背景后荧光叶片图像.

图3 草莓叶片荧光图像预处理

图4为预处理前后的图像灰度等级对比，图中纵坐标PX为像素，横坐标Gray为灰度值.可以看出，通过基于OTSU阈值分割的图像预处理，解决了图像背景微小灰度值问题，将叶面区域以外的灰度值置0，保留原有叶片区域图像灰度及彩色特征，有利于后续参数提取.

图4 预处理图像灰度直方图

2.2 离体叶片干旱胁迫分析

通过观察草莓植株，叶片会在离体后不断失水干枯.采摘长势良好的草莓叶片，放置于载物台上使其自然失水，分析叶片离体后自然干枯失水和叶绿素荧光图像的变化关系，并采集自然失水胁迫状态下0～14 h下的荧光图像.

荧光淬灭曲线的测定一般用调制式叶绿素荧光检测仪，对于外场条件而言，抗干扰性较强，结果较为精确，但价格昂贵.文中使用CCD荧光成像装置进行室内荧光获取，并提取荧光淬灭曲线进行分析.离体叶片经过20 min暗适应后，预设CCD采集速率为1 s，相机曝光时间100 ms.外触发采集主动诱导光源开启后10 min内的荧光图像600张，利用图像处理软件批量背景预处理，并计算每幅图像的平均像素值,分析荧光图像时间序列，提取曲线最大值(Fm)和稳态值(Fs)等叶绿素荧光参数.

图5为叶绿素荧光淬灭曲线，图中纵坐标PXa为像素均值.可以看出：不同采集时刻下荧光淬灭曲线衰减速率不同，离体叶片自然失水0～8 h衰减速率快，8 h之后趋于平缓；离体叶片在自然失水的12 h内其荧光最大值Fm和稳态值Fs都有所下降，从最大值到稳态之间的荧光衰减过程逐渐平缓；离体12 h后叶片体内荧光水平最大值约等于稳态值(Fm=Fs)，相比其他测量时间(2～10 h)有非常明显的降低，荧光图像在主动诱导的10 min内无剧烈衰减.

图5 荧光淬灭曲线

计算荧光衰减比率Rfd与干旱胁迫的天数间的相关性，其中荧光衰减比率Rfd为

Rfd=(Fm-Fs)/Fs.

(1)

以图像中叶面区域所有像素点平均像素值作为上述动力学参数参考数值，荧光衰减比率Rfd与干旱胁迫天数的相关性分析如图6所示.可以看出，Rfd值在离体失水的前2个记录点(0,2 h)时成平稳趋势，在接下来的3个记录点(4，6，8 h)时迅速下降，最后趋于平缓.

图6 Rfd拟合曲线

通过拟合相关性曲线，发现叶片离体后的荧光衰减比Rfd值用Logistic模型拟合度最高，决定系数R2=0.98，拟合公式为

y=A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P]，

(2)

式中各参数具体值分别为A1=2.719 6，A2=0.159 8，X0=6.187 3，P=6.288 3.

2.3 活体叶片干旱胁迫分析

对草莓幼苗进行活体干旱胁迫处理，对2组共20株草莓幼苗进行图像采集.采集过程与离体叶片干旱胁迫图像采集过程一致，在每次荧光图像采集前进行暗处理.拍摄激发开始到稳态阶段的荧光图像，并通过阈值分割提取荧光图像信息.绘制草莓幼苗在不同干旱胁迫分组下的叶绿素荧光淬灭曲线，通过连续绘制激发光源开启后0～10 min内600张荧光图像的像素均值，记录荧光强度从激发开始达到最高值，然后逐渐衰减直至达到稳态的过程，截取荧光强度从最大值衰减到稳态的过程即为荧光淬灭曲线，如图7所示.

图7 草莓幼苗荧光淬灭曲线

图8为试验组A与对照组B在连续7 d干旱胁迫试验中的荧光衰减比率Rfd值变化情况,可以看出：试验组A在7 d内进行持续干旱胁迫，Rfd值波动较大，但干旱胁迫天数与Rfd值之间无明显的相关关系；对照组B在7 d内持续浇水，Rfd值较为稳定，在1.35上下波动.

图8 荧光衰减比率Rfd 散点图

动态荧光指数(DFI，dynamic fluorescence index)是指荧光淬灭曲线到最大值(Fm)与曲线任意一点(Fe)之间连线的最大距离，常被用来分析水分胁迫下植物叶面水势变化相关关系[20]，其定义图如图9a所示，图中纵坐标F为荧光强度.连续高速拍摄的荧光淬灭曲线可以看作是以时间t为自变量不断变化的函数，其中y(t)为荧光淬灭曲线，Fm(t0,yt0)表示荧光淬灭曲线最大值，Fe(te,yte)表示曲线上除最大值外任一定点.

显然，可以写出Fm-Fe直线方程与DFI的数学表达式.Fm-Fe直线的一般方程为

(yt0-yte)t-(t0-te)y+yte(t0-te)-te(yt0-yte)=0.

(3)

DFI即为荧光淬灭曲线y(t)上的动点(ti,yi)到Fm-Fe直线距离的最大值(即荧光淬灭曲线与直线最大距离)，自变量ti取值区间为[t0,te]，DFI计算公式为

(4)

利用图7a草莓幼苗荧光淬灭曲线，分别计算Fe(te,yte)取值荧光淬灭曲线上300～600 s时产生的不同DFI值与胁迫天数的相关性.结果表明，当te=550 s,即Fe为荧光淬灭曲线550 s处对应像素均值时求得DFI值与干旱胁迫天数有较高相关性，决定系数R2=0.84，拟合图如图9b所示，拟合方程为

y=A0+At+Bt2，

(5)

式中各参数具体值分别为A=0.954 6，B=-0.067 2，A0=4.195 1.

图9 动态荧光指数DFI示意图和DFI拟合曲线

2.4 干旱胁迫二维分析

相对于真彩色荧光图像，基于灰度变换法的伪彩色图像转换处理可以提高荧光图像的可辨识度.图10为不同分组胁迫下不同天数的荧光叶片伪彩色处理后的图像.

图10 不同胁迫分组7 d内的荧光伪彩色图像

由图10可以看出：试验组A长期处于干旱状态下的草莓幼苗叶面荧光分布及范围有明显变化，由于光合作用与荧光现象处于竞争关系，叶面荧光均值增大则意味着植物光合效率的降低，在干旱胁迫的第7 d，草莓叶面叶绿素分布明显增多，这表示叶片表面严重失水，光化学反应能力下降；对照组B浇水20 mL/d维持了草莓幼苗光合作用所必需的水分及土壤湿度，其光合速率无较大变化，叶片区域的荧光分布没有较大差异.干旱胁迫引起的叶绿素含量变化在荧光伪彩色图像上表现明显，为农业生产中大面积监测反映植物生理状态提供了一定参考.

3 结 论

1) 通过荧光采集系统对不同干旱胁迫分组下的草莓幼苗进行了图像采集，基于图像处理算法的图像背景预处理方法可避免多次拍摄及设备移动带来的误差，保留叶面区域的荧光数据.荧光图像采集系统通过速率设定可以实现部分传统荧光曲线检测功能，以时间序列采集的叶绿素荧光图像，经过图像预处理，像素灰度平均，可以绘制出荧光淬灭曲线，得到部分荧光曲线参数.

2) 试验表明，离体草莓叶片自然失水可以通过荧光衰减比Rfd与胁迫天数实现检测，决定系数较高.活体草莓幼苗干旱胁迫7 d内Rfd值相比对照组变化明显，但无相关规律.荧光淬灭曲线550 s处的荧光动态指数(DFI)与活体草莓幼苗干旱胁迫天数具有高相关性，可用作草莓幼苗干旱指示预警.

3) 结合图像的叶绿素荧光分析方法相对传统的荧光检测方法经济方便，不同分组下的荧光图像在二维方向上直观地解释了在干旱胁迫下植株内部叶绿素含量变化导致的植物生理状态变化.但成像过程极易受到环境因素干扰，荧光图像后续处理步骤繁杂，部分作物的受胁迫反映并不一致，如何大面积的应用在农业经济领域是需要解决的问题.