间充质干细胞外泌体对眼部疾病的治疗作用

王亚鹏，李江伟，彭 俊，周亚莎，龙 达，彭清华,

0引言

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群具有多向细胞分化潜能和自我细胞更新的多能干细胞，可从多种组织如胎盘、脐带、脂肪、骨髓、肌肉和牙髓等中获取[1]。MSCs具有保护神经系统、多向细胞分化、抑制机体炎症反应和促进免疫系统调节等多种生物学功能。研究发现MSCs的功能与其旁分泌机制(尤其是外泌体)有着密切的联系。MSCs来源的外泌体(mesenchymal stem cells-derived exosomes，MSC-Exo)是MSCs旁分泌作用的主要物质，是一种包括信使RNA、微小非编码RNA(miRNA)、双层脂质、蛋白质的细胞外囊泡小体，其大小均一，直径为30～150nm，密度为1.13～1.18g/mL，其传递是通过进入细胞内吞泡膜向内凹陷而形成多泡内涵体并与细胞膜融合而释放[2]，可避免其携带的特异蛋白质和mRNA在分泌到细胞外后被迅速吸收降解，从而可在整个细胞外保持稳定的机体生物学活性，到达机体远端发挥作用，并可长时间保持有效生物学功能[3]。研究表明，MSC-Exo通过传递蛋白质和RNA完成细胞间的通讯，可实现介导MSCs的促进修复、保护神经、免疫系统调节等功能[4-5]。MSC-Exo在肝肾肺脏损伤修复，骨骼肌、软骨、神经组织、口腔组织、心血管再生和皮肤创口愈合等多种疾病中具有重要的治疗作用[6]，相比较MSCs而言，外泌体更加稳定，易于修饰，且不具有成瘤性的风险。此外，由于外泌体的纳米级尺寸和双层脂质膜结构，可以很容易地通过人体生物屏障进入靶向免疫器官和细胞发挥治疗作用。研究表明，MSC-Exo对各种眼部疾病如干眼、抑制角膜移植排斥反应、视网膜脱离、黄斑变性、青光眼、自身免疫性葡萄膜炎等具有治疗潜能[7-8]。现就MCS-Exo在眼部疾病中的作用及临床应用前景进行讨论。

1对干眼的治疗作用

干眼(dry eye，DED)是一种以泪膜内稳态丧失为特征的眼表多因素疾病，伴有泪膜稳定性差、泪液高渗性、眼表炎症等[9]，目前该病的患病率不断提高，严重影响患者的生活质量。国际泪膜和眼表协会(Tear Film and Ocular Surface Society,TFOS)与国际干眼研讨会(International Dry Eye Workshop，DEWS)一致认为，泪液高渗性和泪膜不稳定性是DED的核心病因，众多学者认为DED发生的关键因素是泪液渗透压增高诱导的眼表炎症。有研究表明，DED患者及动物模型中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α呈现高表达，这对眼表炎症的发生及发展具有重要作用，且表达水平与DED的严重程度呈正相关。目前，DED无法治愈，目前主要的治疗方法为采用人造眼泪、抗炎滴眼液和局部免疫抑制，目的是改善慢性角膜炎症的症状[10]。

前期研究已知MSCs显示出具有角膜上皮前体细胞的形态特征，可检测出Integrin D1、Cx43、Pax6和P63等角膜上皮前体细胞的标志，说明适宜条件下MSCs能诱导分化为角膜上皮前体细胞[11]。蔡丽萍等[12]研究发现，在苯扎氯铵诱导的小鼠干眼模型中，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)滴眼组及眼眶注射组均可有效降低眼表炎症指数、降低荧光素染色评分(corneal fluorescein staining，FLS)、延长泪膜破裂时间(tear break-up time，BUT)、修复角膜上皮，表明其对DED有一定的治疗作用。王希莲等[13]研究发现，静脉输注人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)或兔脂肪来源的MSCs能有效缓解兔自身免疫性干眼的病情进展，且在发病前预防性输注hUC-MSCs能够取得相似的治疗效果，但静脉输注MSCs有一定的风险，故临床应用有局限性。

李娟等[14]用MSC-Exo处理小鼠干眼模型后，进行小鼠泪膜功能相关检查，包括泪液分泌试验(SchirmerⅠtest，SⅠt)、BUT、FLS测定，发现MSC-Exo组BUT延长，SⅠt增加，FLS评分降低，组织病理学结果显示小鼠角结膜中浸润的炎症细胞减少，角膜上皮细胞形态更加规整，微绒毛浓密，治疗效果明显。相关研究表明[15]MSC-Exo能够降低炎症分子IL-1β、IL-6、TNF-α的转录，说明MSC-Exo可以减轻DED小鼠角膜上皮的损伤。

李娜等[16]实验发现在兔自身免疫性干眼模型的泪腺组织中TNF-α和IL-1β mRNA表达显著增加，而抗炎因子IL-10 mRNA表达下调，人脐带间充质干细胞来源外泌体(hUC-MSC-Exo)可诱导外周血中单核巨噬细胞向抗炎性M2表型极化，从而有效促进IL-10、TGF-β分泌，抑制巨噬细胞相关炎性因子如TNF-α和IL-1β分泌，达到抑制炎症反应的效果。

2对角膜移植排斥反应的免疫抑制作用

角膜病是世界上最常见的与失明相关的眼病之一，是我国第二大致盲眼病，临床证实其可靠、有效的复明手段为角膜移植手术。正常生理情况下，角膜属于自体免疫特殊区域，但由于是同种异体移植，移植的角膜可引起移植体内抗原抗体反应，致使角膜植片混浊、功能丧失，甚至失明，从而导致角膜移植失败[17]。角膜移植后排斥反应是多种细胞(如T、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等)和免疫分子参与的免疫排斥反应[18]。在角膜移植排斥反应的高危患者中，减少或防治角膜排斥反应是提高手术成功率及患者生活质量的关键[19]。目前临床主要用糖皮质激素、环孢素A滴眼液等，但长期使用可诱发青光眼、白内障、肝肾毒性等疾病及不良反应，故优化治疗尤为重要。

Jia等[20]前期研究发现，在大鼠结膜下注射MSCs或尾静脉注射MSCs可抑制炎症反应和上调Th2细胞因子，在对MSCs进行示踪观察后，发现结膜下注射MSCs后72h，结膜囊中存在大量MSCs，但前房以及角膜组织中未见表达，总体效果可延长角膜植片存活时间。贾喆等[21]通过进一步研究发现，比较结膜下注射MSCs和MSC-Exo后角膜植片存活时间，发现24h后结膜囊、角膜组织中以及前房内均可见外泌体的定位表达；72h后发现结膜囊中外泌体存在量极少，最终MSCs-Exo治疗组角膜植片的存活时间更长。因此得出结论：MSCs-Exo可以发挥免疫调节作用，能够调节免疫应答并促进免疫组织修复，抑制T细胞免疫应答、改变Th1/Th2免疫应答平衡以及上调调节性T细胞，可以克服体内生物屏障到达角膜以及前房从而发挥生物学功能，对抑制角膜移植术后细胞排斥反应有一定作用。

3对视网膜细胞及视神经损伤的保护作用

损伤、感染或局部缺血引起的视网膜细胞损伤会触发邻近神经细胞的变性，导致视网膜形态和功能的损伤以及不可逆的视力损害[22]。目前干细胞移植、抗炎药、信号通路抑制剂、神经营养因子等在各种视网膜疾病模型中均显示出神经保护作用[23]。既往研究证明，静脉注射MSCs可通过抑制细胞凋亡和炎症反应来挽救视网膜激光损伤[24]。王宁等[25]通过在大鼠视网膜下移植BMSCs，推测BMSCs的作用机制可能与其分泌细胞因子bFGF而起到营养支持和多向分化的潜在功能有关，其可通过改善视网膜微环境而起到保护光感受器细胞的作用。

Yu等[26]在激光诱导的视网膜损伤小鼠模型中，通过在玻璃体腔注射MSC-Exo，发现视网膜中单核细胞趋化蛋白(MCP-1)明显下调，热损伤后的视网膜细胞中的MCP-1 mRNA表达也明显下调。这些结果表明，玻璃体腔注射MSC-Exo可通过下调MCP-1减少视网膜损伤，抑制细胞凋亡和巨噬细胞浸润，从而保护视网膜结构和功能。Mead等[27]研究发现，在以视网膜神经节细胞(RGC)死亡和轴突变性为特征的大鼠视神经挤压(ONC)模型中，BMSC-Exo中的miRNA展现出显著的神经保护和促进神经再生作用。因而推测，BMSC-Exo可以有效促进视网膜创伤修复，抑制炎症和免疫，保护视网膜神经功能，具有较好的潜在临床应用价值。

视网膜脱离(retinal detachment，RD)是视网膜神经上皮层与色素上皮层的物理分离，是最常见的威胁视力的疾病之一。马明明[28]研究表明，MSC-Exo含有抗炎、神经保护和抗凋亡的蛋白效果，可以减轻RD对光感受器细胞变性的影响，能抑制炎症因子的产生，增强光感受器细胞的自噬，减少凋亡，发挥保护视网膜的功能[29]，从而对RD诱导的视网膜损伤具有治疗作用。

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是一种多因素的进行性致盲眼病，是50岁以上人群不可逆性视力下降的首要原因[30]。已知脉络膜新生血管(CNV)是ARMD的主要病理改变，而血管内皮生长因子(VEGF)是促进CNV形成的主要生长因子，其中VEGF-A与眼内新生血管生成密切关联。何广辉[31]将hUC-MSC-Exo按照不同作用浓度注射到动物眼球中，通过荧光造影检查和免疫组织化学染色检测发现CNV动物模型的渗漏情况较对照组好转，并下调CNV形成处VEGF-A蛋白的表达，表明hUC-MSC-Exo能够改善光损伤所致的细胞形态学改变，且与作用浓度和作用时间呈正比。

糖尿病性视网膜病(DR)是老年人视力丧失的主要原因之一，视网膜中炎性细胞因子的增加与DR中的视网膜病变程度密切相关。Zhang等[32]和Liu等[33]研究发现，MSC-Exo中miR-126在调节高血糖诱发的视网膜炎症因子的表达中起关键作用，过表达miR-126的MSC-Exo在糖尿病大鼠中显著降低了视网膜内皮细胞中高糖诱导的HMGB1表达和NLRP3炎性小体的活性，从而改善了糖尿病大鼠的高血糖诱导的视网膜炎症。

青光眼(glaucoma)是导致不可逆性失明的一种进行性视神经病变，全世界有超过7 000万人受到本病的影响[34]。其特征是RGC的逐渐丧失，眼内压升高(IOP)被认为是导致青光眼RGC凋亡增加的主要原因。Harrell等[35]在青光眼动物模型玻璃体腔注射MSCs后发现，注射后可产生神经营养蛋白和免疫调节因子，可诱导RGC的扩增和再生，提供小梁网完整性，并减轻视网膜炎症。Mathew等[36]表明MSC-Exo能够在玻璃体内给药后至少停留4wk，并且由于其纳米尺寸，可能会迅速到达RGC，为它们提供神经营养蛋白，最终达到保护RGC的作用。

4对自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

自身免疫性葡萄膜炎是一种涉及葡萄膜和视网膜的自身免疫性疾病，是全世界视力障碍的主要原因，全身或局部给予皮质类固醇联合免疫抑制药物是自身免疫性葡萄膜炎的传统治疗方案[22]，但长期使用会有全身性副作用以及白内障和青光眼的风险[37]，因此优选球周/眼内注射药物治疗。Li等[38]既往研究发现，在大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型中静脉输注大鼠MSCs可以抑制T细胞增生，下调Th1、Th17效应细胞，上调Th2、Treg细胞，能有效预防和治疗抗原诱导的EAU发生发展；研究发现在球周注射人来源的MSC-Exo治疗大鼠EAU，可显著抑制病情，保护视网膜。

Bai等[39]发现在EAU大鼠模型局部应用MSC-Exo，可以有效抑制炎症细胞的迁移，并显著降低CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+的百分比。这些发现表明，眼周注射MSC-Exo至少部分地通过抑制白细胞迁移而发挥有益作用,且眼周注射人MSC-Exo可通过下调MCP1/CCL21和MYD88依赖性途径来降低白细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的浸润和迁移，减少EAU大鼠的白细胞浸润，保护视网膜结构并挽救视网膜功能。这些研究的结果表明，MSC-Exo可用于治疗人类自身免疫性葡萄膜炎。

5小结

目前，对外泌体的研究热潮方兴未艾，相比于MSCs在多种疾病中的直接治疗，MSC-Exo具有毒性小、免疫原性低、靶向归巢能力强和可包载的物质种类多等特点[40]，因此在使用、转移过程中更安全；MSC-Exo可通过特定细胞在特定环境下的培养、扩增而获得，获得方式更便捷，获取成本更低，速度更快；同时，MSC-Exo还能够修饰为特定的特异性细胞分子，更能提高治疗效果；MSC-Exo是天然纳米囊泡，在药物递送载体上具有先天优势。可见，MSC-Exo在安全性、作用剂量、作用效果方面均优于MSCs，更具有应用前景与价值[41]。但目前对MSC-Exo在眼部疾病中的治疗时间、治疗量，以及其发挥治疗作用的机制仍缺乏全面的认知，对MSC-Exo的探究需进一步的基础医学和转化医学研究推动发展以及研究者的共同努力。