血-视网膜内屏障体外模型构建研究进展

袁 晨，张 梅，谢学军

0引言

血-视网膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)是视网膜重要的生理结构，能够调节眼血管床和视网膜组织间液体和分子运动，防止大分子和其它有害物质渗入视网膜，在维持正常血管功能的生理屏障、保持视网膜和视网膜神经元微环境方面具有重要的作用[1]。BRB包括内层视网膜屏障和外层视网膜屏障两部分。由于血-视网膜内屏障(inner BRB，iBRB)功能的损害是引起糖尿病视网膜病变等视网膜血管性疾病发生的主要原因，因此该领域研究正愈加被关注。阐明iBRB的结构组成及功能并建立一个理想的体外模型对推进生理生化、病理药理及临床等方面的研究具有较大的理论与临床意义。

1血-视网膜内屏障的结构组成

iBRB是由单层紧密附着的视网膜微血管内皮细胞(retinal microvascular endothelial cell，RMEC)、周细胞(pericytes cell，PC)、星形胶质细胞(astrocytes cell，AC)及基底膜共同构成的神经血管单位，它存在于视网膜神经层的血管与神经组织之间，是一个动态的调节结构[2]。

1.1视网膜微血管内皮细胞视网膜微血管内皮细胞位于视网膜血管内壁，形态扁平，单层生长，具有复杂的紧密连接(tight junctions，TJs)，提示RMEC是屏障内皮细胞，能严格筛选药物及外源性物质的通透；RMEC具有丰富的线粒体，能为细胞主动转运物质提供高能量，所以RMEC对维持血管的正常通透和物质的正常转运起到了关键性作用。RMEC是构成iBRB和维持其功能完整性至关重要的结构，与其直接接触的星形胶质细胞和周细胞共同保持着iBRB的完整及致密性。RMEC不仅能够确保视网膜的营养及氧气的供应，还有助于iBRB将循环产生的毒素分子、炎症免疫细胞等排出体外，以达到保护视网膜的作用[3]。所以，RMEC在保证正常的iBRB、正常的微血管功能方面发挥着十分重要的作用。

1.2周细胞PC是广泛分布于全身毛细血管壁的结构细胞，典型的成熟组织内周细胞位于微血管内皮细胞的外侧壁，两者间存在着紧密连接、缝隙连接、针-槽复合体和黏着斑等多种连接方式，并由共同的基底膜包绕，维持了血管壁的完整性[4-6]。PC不仅提供机械支持，而且与内皮细胞一起构成微血管和组织间隙的屏障，并通过物理接触与旁分泌信号与内皮细胞进行相互作用，调节血-视网膜屏障的通透性、视网膜血流以及应激反应，是维持内环境稳定的重要因素[7-9]。视网膜具有很高的PC密度，PC与内皮细胞的比例约为1∶1，PC在不同组织器官分布密度的差异与其调控毛细血管屏障、内皮增殖及维持毛细血管张力及直径等生理作用是一致的[10-11]。普遍认为，PC数量越多，被覆盖率越高，微血管的屏障功能就越好[12-13]。有学者发现，同血-脑屏障的发育相似，PC可能通过为视网膜内皮细胞形成屏障特性提供合适的微环境而参与iBRB的早期形成。虽然iBRB的紧密性主要是由内皮细胞之间紧密而黏附的连接介导的，但PC已被证明是iBRB的重要组成部分[14]。

1.3星形胶质细胞RMEC被PC覆盖，而PC又由AC支持[15]。视网膜中的AC包括原浆型星形胶质细胞、纤维型星形胶质细胞，还有脊椎动物视网膜中特有的视网膜Müller胶质细胞[16](retinal Müller glial cell，RMGC)，RMGC仅在视网膜中发现，并且是唯一的几乎覆盖整个视网膜厚度的视网膜细胞。AC的突起发出分支，借助血管足附着于血管壁上，形成毛细血管的外围界膜，不仅维持了视网膜毛细血管的完整性[17]，而且在内皮细胞由非屏障细胞向屏障细胞转变的诱导、维持和增强屏障特性等方面发挥着重要的作用[18-20]。同时，AC还具有很强的分泌作用，通过分泌各种因子(如转化生长因子-b、胶质细胞源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管生成素-1等)，调节iBRB的屏障作用，并调节血管张力和血流量[21-23]。所以说，AC在维持iBRB结构和特性方面均起着关键作用。

1.4基底膜基底膜是iBRB的重要组成部分，它是位于RMEC和PC之外的一层无定形的连续性膜结构，两者通过共享的基底膜连接进行交流，起到调节和限制物质交换的作用，是血液和组织间的一道屏障[24]。基底膜由3个并列蛋白组成，它们分别为结构蛋白(胶原蛋白和弹性蛋白)、特殊蛋白质(纤连蛋白和层黏连蛋白)和蛋白聚糖[25]，这些蛋白又由不同的细胞外基质分子组成。除了内皮细胞自身可合成部分基底膜成分以外，PC和AC也是这些细胞外基质的重要来源，它们共同参与形成并维持视网膜毛细血管的基底膜[26]。基底膜的破坏势必影响iBRB的屏障功能。

1.5紧密连接研究发现，屏障功能最重要的部件是TJs[27]。TJs是功能性的细胞间结构，它们封闭细胞间隙，在相邻细胞之间形成屏障，通过不断地密封和解封，以调节液体、离子和小分子等的运输，控制内皮细胞的细胞旁通透性[28]。除了对细胞旁通道的屏障功能外，TJs还具有另一种屏障功能，阻碍顶端和基底外侧膜蛋白和脂质的扩散，从而参与细胞极性[29]。TJs是由含有跨膜蛋白(封闭蛋白Claudin、闭锁蛋白Occludin和连接黏附分子JAM)和外周胞质蛋白(如带状闭合蛋白zonula occludens1-3，ZO1-3)的多蛋白复合物形成的独特组合[30]。屏障功能的改变与TJs蛋白的蛋白表达、磷酸化、泛素化和亚细胞分布的改变有关[31]。现已有大量研究证明，TJs是iBRB的结构及功能的重要基础，视网膜病变能够导致TJs的改变，从而对iBRB造成破坏[32-35]。

2血-视网膜内屏障的功能

iBRB通过视网膜内皮细胞间的紧密连接及周细胞、星形胶质细胞等其它细胞的参与形成了结构屏障，这种“屏障”起到了视网膜和血液循环之间选择性分隔的作用，并维持了高度专业化的神经紧密连接环境。应该强调的是，BRB并不是分子从循环到视网膜交换的绝对障碍。相反，它提供了一种选择性机制，允许和促进营养物质进入视网膜，并且排除和阻止潜在危险性物质通过，以便视网膜可以顺利调节其内环境，以应对不同的新陈代谢需求。iBRB是一个动态变化的结构，可以通过多种途径和细胞间的相互作用来调控视网膜在生理、病理情况的功能，如对紧密连接蛋白[36-37]、转运载体[38-39]及酶类[40-41]的调控。iBRB功能的改变与许多病理过程联系紧密，若屏障功能遭到破坏，会引发甚至加剧许多视网膜血管性疾病的发生发展，如糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、葡萄膜炎等。所以，iBRB结构的完整和功能的维持是拥有正常视力所必需的。

3血-视网膜内屏障体外模型的构建

建立体外iBRB模型是重要的研究手段，便于我们能对iBRB病理生理状态进行更加深入的研究。只有使用比较理想的体外模型，所得出的结论才能更接近体内实际情况，预测才更具有实际意义。一个理想的体外iBRB模型不仅要有和体内一致的细胞形态和生理结构分布，还要具有尽可能多的iBRB的生理特征。现体外iBRB模型的建立在不断发展和完善。

3.1 RMEC模型

3.1.1单视网膜微血管内皮细胞模型RMEC是iBRB的核心成员，单独培养的RMEC能够较好地保持在体特征，基本可以模拟iBRB功能，这是最简单可行也是最常见的用于研究iBRB通透性的体外模型。目前使用的RMEC来源各异，国内外已可以将人、鼠、猪、兔、山羊、恒河猴和牛的视网膜内皮细胞进行体外培养实验，其中对于iBRB的研究常采用人、鼠和牛来建立体外模型，通常采用机械的方法或者某些消化酶来分离视网膜微血管，并通过添加不同生长因子、磁珠标记法、物理刮除法等密度沉降分离法等来得到纯度较高的内皮细胞。体外RMEC单层模型大多是在静态系统培养条件下，将RMEC直接接种于培养皿或跨膜小室(Transwell)上培养,待细胞成功融合会呈现单层铺路石样排列，并出现接触抑制，可通过PECAM-1、CD31、Ⅷ因子等特异性标记物进行鉴定，通过测量跨内皮细胞电阻值(TEER)、HRP通透性等方法进行生理特性的鉴定[42-43]。

3.1.2二元培养模型iBRB上的各种细胞均有自身独特的空间定位，这是细胞之间进行相互作用以及维持屏障功能的基础。研究认为随着时间的推移，单独培养的RMEC会逐渐丧失iBRB在体内的许多特性，有学者选择将RMEC与组成iBRB的其它细胞进行共同培养，发现RMEC加入其它细胞后能更好模拟体内微环境状态，具有更好的屏障特性。Tretiach等[44]测量了在小孔径(0.4μm)和大孔径(3μm)聚碳酸酯Transwell过滤器上的牛视网膜毛细血管内皮细胞单培养的电阻，并将其与内皮细胞和Müller细胞的共培养进行了比较，然后将每组中电阻最高和最低的制剂固定并在培养8～9d后进行电子显微镜检查，发现在0.4μm滤膜上，尽管共培养的内皮细胞和Müller细胞在滤膜两侧之间没有直接接触，但共培养组的TEER显著高于内皮细胞单独培养，表明在内皮细胞附近的Müller细胞对屏障功能有积极的影响，而不仅仅是内皮细胞和Müller细胞的相加作用。之后Tretiach等[45]又通过对TEER和菊粉通量测量，发现在常氧条件下，RMEC与RMGC共培养组较RCEC单层具有更佳的屏障功能。郭斌[46]将RMEC与RMGC在微孔膜上共培养建立了体外大鼠iBRB模型，发现RMGC可以促进RMEC之间的TJs形成，提高屏障功能。通过多位学者的研究，得出了RMEC与RMGC共培养模型制备的方法一般是将RMEC与RMGC分别接种于0.4μm孔径微孔膜的Transwell小室的内、外底面，共培养后两种细胞均能贴壁生长，由于微孔膜的存在，细胞之间可以进行相互作用但并未直接接触，示踪剂通透性试验和TEER可证实内皮屏障的形成。

周细胞在iBRB中同样具有重要的作用，近年来，有学者将RMEC与周细胞进行共培养用于研究两种细胞之间的联系、可溶性分子的交换或仿生组织微环境内的相互作用。Diana等介绍了三种人视网膜微血管内皮细胞(HREC)与牛视网膜周细胞(BRP)共培养的方式，其中包括了二维(2D)直接和间接共培养方法[47]。直接培养的方式是将HREC与BRP按1∶1的比例在培养板中共培养，间接培养是将周细胞接种在6孔或24孔板上过夜，第2d将内皮细胞以1∶1的比例接种在相应的Transwell上腔中继续培养，从而将两种细胞进行共培养。

3.1.3三元培养模型Nakagawa等[48]采用大鼠脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞，发现不同共培养模型的TEER值明显不同:三元共培养>周细胞二元共培养>胶质细胞二元共培养>脑微血管内皮细胞单培养，由于iBRB与血-脑屏障(BBB)高度的相似性，学者们在此基础上建立了iBRB的三元培养模型。Wilkerson等[49]将原代HREC、视网膜周细胞和Müller细胞分别以3∶1∶1的比例在载玻片中建立iBRB的Tricell培养模型。更多的三元培养模型是将3种细胞同时接种在Transwell培养池中，RMEC被接种在微孔膜上方，周细胞在膜下方贴膜接种，星形胶质细胞在培养池底部贴壁接种，同样可以使用荧光示踪剂及TEER测量等方法对屏障完整性进行评定[15，50]。

3.2永生化细胞模型自从Greenwood等[51]提出了“由大鼠BBB和BRB衍生的永生细胞系是研究特殊细胞屏障有用工具”的观点后，以Hosoya等[52-53]为代表的一些学者进行了更为深入的研究，他们成功建立的条件永生的视网膜毛细血管内皮细胞系(TR-iBRB)，具有视网膜毛细血管内皮细胞的特性。这种由Tg大鼠建立的屏障细胞系具有体内转运功能，不仅是药物转运至视网膜的良好体外模型，并且是筛选可能传递至视网膜的药物的良好模型[54]。Shen等[55]将TR-iBRB细胞接种在可渗透膜滤膜上生长，通过测定一些药物化合物成分在跨培养细胞层的转运，以确定表观渗透系数(Papp)，发现此模型为预测整个BRB的渗透性提供了有用的工具，但该模型对眼后部候选药物的高通量筛选和排序在治疗眼病方面的有效性需要通过与活体数据的相关性进行进一步的论证。2000年，Hosoya从Tg大鼠中获得了九种永生化的大鼠视网膜毛细血管内皮细胞系(TR-iBRBs)，并将其命名为TR-iBRB1-9，到目前为止TR-iBRB2应用最为广泛。Kubo等[56]根据初始吸收率(V)和Papp，研究了BRB渗透率与膜渗透率之间的关系，其中对TR-iBRB2细胞的摄取研究表明，它在基于体外分析的被动扩散和载体介导的药物转运的系统BRB通透性评估中具有很好的应用前景。TR-iBRBs取材于具有温度敏感的SV40大T抗原基因的转基因大鼠(Tg大鼠)中，温度维持在33℃时，TR-iBRBs细胞将永生并迅速生长。这种细胞能够表现出内皮特征性的纺锤状纤维状形态，同时还表达vonWillebrand因子作为内皮细胞标志物，并且是乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的清除剂受体。

3.3通过3D细胞外基质建立iBRB体外模型迄今为止，大多数基于细胞的测定法都使用传统的二维培养方法，即将细胞培养在平面环境中，但在体内，细胞则被其他细胞、组织和细胞外基质(ECM)重重包围。尽管历史悠久的2D细胞培养已被证明是用于细胞研究的一种有价值的方法，但2D细胞培养无法充分考虑细胞的自然3D环境，其局限性已得到越来越多的认识。于是，研究人员开始尝试3D细胞培养，并观察它与2D培养的差异。而最近几年出现了三维水凝胶、ECM和固体支架所建立的3D培养模型[57-58]，已经有越来越多的证据表明3D细胞培养与2D培养系统相比可以更准确地表示细胞在组织中驻留的实际微环境。Diana等将猪小肠做成ECM支架，先在支架上接种5×104个HREC，孵育2h后，加入等量的BRP，使两种细胞共培养以研究它们在3D仿生环境中的相互作用[47]。Beharry等[17]分别将HREC和人视网膜星形胶质细胞(HRA)在Transwel(2D)及AlgiMatrix、Geltrex基质等2种可生物降解的3D水凝胶支架上共培养，其中AlgiMatrix是一种非动物来源的海绵，由冷冻干燥的海藻酸凝胶制成。接种细胞前，将细胞重悬，并加入10%(v/v)的AlgiMatrix固化缓冲液。用细胞悬液接种在海绵上。5min后，再向海绵中加入不含固化缓冲液的培养基，进行孵育。对于HREC和HRA的共培养，首先接种HRA，48h后，将海绵翻转用于接种HREC；Geltrex基质是一种基底膜提取物，含有IV型胶原、层黏连蛋白和其他基质蛋白和生长因子，在15℃以上5～10min内形成凝胶先将Geltrex基底膜在4℃下解冻过夜。第2d，培养皿表面包被Geltrex基质，置于培养箱30min后先接种HRA，48h后在HRA上直接接种HREC，使两种细胞共培养。将实验进行比较后，他们发现HRA增强和促进间歇性缺氧状态下HREC的反应，并且在3D支架上培养的细胞表现出较少的氧化应激反应，所以认为在3D支架上共培养的HREC和HRA可能概括了动态iBRB的药物反应，在临床眼科药物的发现和开发上有很好的应用前景。

4总结和展望

由于体内实验耗时耗力，且存在动物种属差异、伦理限制等多种复杂因素的干扰，而体外模型更加可控、经济，故体外模型的建立具有十分重要的意义。选取适合的体外培养模型是实验的关键，这就需要根据研究目的并结合各种模型的优缺点进行选择。

单层RMEC模型能够较好地保持在体特性，其显著优点是易操控并可表达多种重要的转运蛋白，可应用于研究信号通路、转运动力学、药物的高通量筛选以及结合亲和力的测量。因RMEC培养技术已比较成熟，应用较广泛，故它是药理学研究中最常用的体外培养模型之一。但原代培养的RMEC需多次重复传代纯化才能获得足够数量的实验细胞，且这种模型结构单一，其忽略了其它细胞群之间的信号传导和机械性刺激的致敏性调节，且不易形成单层TJs，很大程度限制了长期维持iBRB模型特性的能力。同时模型TEER较低，渗透性较高，与体内实际情况差距较大。

据以往研究可知，周细胞和胶质细胞均在调节RMEC紧密连接及维持iBRB结构和功能方面起着重要的作用。这种将细胞共培养的多元培养形式所反映的细胞间的移动以及动态的相互作用与体内更加相似，能够增加iBRB的紧密连接，更加充分地模拟在体微环境，体现内皮细胞的屏障作用，同时在展示结构复杂性的研究中更具有代表性。多细胞共培养模型可通过对各种细胞之间及细胞与内环境之间的相互作用进行研究，也可进一步探究药物对细胞的作用和疾病的损伤机制。但由于各种细胞的培养较复杂，成本较高，共培养操作步骤较为繁琐，在模型的广泛应用方面具有一定的局限性。并且这些模型培养的细胞往往缺乏极性，故只具有部分屏障功能，只适合于进一步的物质通透性研究。

永生化细胞是已知增殖效果好，能保留亲本重要形态、特性及功能的细胞，而且可以避免原代细胞提取过程的繁琐步骤，也排除了其他细胞的污染，有利于细胞的纯化。模型的来源稳定，制备成本较低，效率高。但是此种模型分化程度较低，并不能完全体现iBRB的特点。而且模型渗漏性较高，TEER值小，不宜进行通透性筛选试验，多通过细胞摄取试验研究生理或病理条件下iBRB的转运机制[59]。

通过3D细胞外基质建立的iBRB体外模型比2D培养系统更具有生理学意义，可较好地表现出细胞和细胞外基质的相互作用，并且能更好地模拟细胞在组织中生长及作用的实际微环境，能更加准确地反映出体内细胞的各种反应。细胞在三维支架上的共培养模型可以作为临床前药物发现和开发的强大仿生模型，可以应用于新药开发及筛选的最初几个阶段用于靶点识别，药物剂量优化，以及在后期Ⅱ/Ⅲ期试验中减少药物毒性和治疗失败等多方面[60]。水凝胶基质，是一种水溶性聚合物，由于其高含水量，与玻璃体液体相似，因此非常适合眼科应用。而且它们另外一个优点是可以保护药物，延长平均停留时间，并能持续给药。但这种3D微环境也存在着许多缺陷。例如缺乏剪切应力或细胞培养时，氧气、营养以及可溶性的生长因子的分布在整个培养层中可能会是不均匀的，而且凝胶也会随着介质的扩散出现梯度[61]。

随着对iBRB生理、病理的研究逐渐深入，在体外建立iBRB模型的研究也从简单的单细胞培养逐步发展到多元共培养、永生化细胞系及3D细胞外基质等方法，iBRB模型的模拟程度越来越高，具有更多的功能性，并且更贴近体内微环境。但目前所有的体外iBRB模型各有其优缺点，使得体外iBRB模型的研究需不断完善，以便为人们在科研道路上取得更多进展提供更好的基础。