自噬与自噬通量在急性脑损伤中的研究进展

(1临沂市中医医院，山东 临沂 276000；2 临沂市人民医院)

自噬在真核生物中主要起到清除受损或老化蛋白质以及内质网、核糖体、线粒体等细胞器的作用。各种应激下，自噬在维持细胞存活、恢复细胞稳态方面起到至关重要的作用。然而，在特定的情况下会引起细胞死亡。自噬通量定义为货物通过自噬系统的整个过程，从吞噬体形成到自噬体形成，再到自噬体与溶酶体融合，以及最终的货物降解与回收再利用[1]。自噬通量受损参与了许多人类疾病，包括癌症、心血管疾病、免疫介导疾病、肌病和神经变性疾病[2]。研究清楚脑损伤后自噬的机制有助于为其提供新的治疗靶点。本文对自噬的发生机制以及在脑损伤后细胞内自噬及自噬通量的变化进行综述。

1 细胞自噬

1.1自噬的分类 自噬可分为：分子伴侣介导的自噬(CMA)、小自噬、大自噬[3]。CMA是一种高度选择性的途径，只有含有伴侣识别位点的可溶性蛋白才能被识别，如热休克蛋白70(Hsc70)复合物或其他。一旦Hsc70复合物与溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)结合后，底物就会运送到溶酶体被降解[4]。与大自噬不同的是，小自噬不需要形成自噬体，底物直接被溶酶体吞噬降解[5]。在这三种自噬中，大自噬被研究得最为广泛，是最具特征的自噬形式。通常意义上的自噬指的是大自噬。本文主要探讨大自噬(以下简称自噬)。

1.2自噬的过程 自噬的过程包括四个步骤：诱导吞噬体的形成；自噬体的形成；自噬体与溶酶体结合；降解再循环诱导吞噬体的形成。在酵母自噬中，自噬体形成的诱导受Atg1-Atg13-Atg17-Atg31-Atg29激酶复合物的调节。在哺乳动物细胞中，该复合物由一个来自Unc-51样激酶家族(ULK1或ULK2)的Atg1同系物、哺乳动物Atg13同系物(ATG13)和一个RB1诱导的卷曲线圈1(RB1CC1/FIP200)组成。

在自噬体形成的过程中，吞噬体的伸长导致典型的双膜囊泡自噬体的形成。做到这一点，需要同时执行两种不同的途径。第一种是Atg7激活Atg12，然后Atg10介导Atg12和Atg5的结合，该Atg12-Atg5复合物随后与Atg16连接，产生一个Atg12-Atg5-Atg16复合物。第二个与吞噬泡延长相关的泛素样蛋白系统是Atg8/LC3。LC3被ATG4处理以显示C-末端甘氨酸(LC3-I)，ATG7是一种E1样酶，激活LC3-I并将其转移到E2样酶ATG3，ATG12-ATG5-ATG16L1复合体可以作为E3连接酶参与PE与LC3-I的结合创造LC3-Ⅱ，它可以和吞噬体联系在一起。LC3-Ⅱ随后可被ATG4切割以释放LC3。不断延长的吞噬泡最终会成熟并融合为完整的自噬体。接着，自噬体与溶酶体融合成自噬溶酶体，并且LC3-Ⅱ从自噬溶酶体的膜中完全解离。随后，p62与自噬体内膜上的泛素化底物和LC3结合物在自噬溶酶体中被降解[6]。自噬体的底物在自噬溶酶体中被溶酶体水解酶降解，由此产生的小分子物质被循环再利用。3-甲基腺嘌呤(3-MA) 和渥曼青霉素作为自噬抑制剂都具有抑制PIK3C3的作用[7]。而巴弗洛霉素A1和氯喹则通过中和溶酶体溶酶体pH值和阻断自噬体与溶酶体的融合起到抑制自噬的作用[8]。

2 自噬与脑损伤

2.1自噬与创伤性脑损伤 创伤性脑损伤(TBI)包括大脑的最初物理损伤及继发性、长期的脑组织退化。继发性损伤相对于原发性损伤对脑组织的损伤更严重更持久，并涉及许多并发症，例如Ca2+浓度失调、自由基产生、缺血、水肿及颅内压增高等[9]。

自噬在TBI中的作用存在争议。在一项大鼠液压冲击脑外伤模型的研究中，大鼠脑损伤后自噬被LC3-Ⅱ、自噬体和自噬溶酶体的积累激活，从而起到神经保护的作用。相反，Luo等运用自由落体制备TBI小鼠模型，在制造模型前使用自噬抑制剂3-MA和巴弗洛霉素A1，发现LC3-Ⅱ、Beclin 1水平升高，p62水平降低，并且提高了水迷宫学习能力，减少了细胞凋亡，反证了自噬具有脑损伤作用[10]。

2.2自噬与脑缺血性损伤 与TBI一样，自噬在缺血性脑损伤中的作用也存在争议。多项研究表明，使用雷帕霉素增强自噬具有神经保护作用，包括使用新生儿缺氧缺血模型和短暂性和永久性大脑中动脉阻塞(MCAO)模型[11]。在一项对10天大的大鼠单侧颈动脉结扎和低氧血症后的最新研究中，使用Antagomir(AT)抑制miR-30d-5p后使自噬增强，抑制细胞凋亡，从而减少了梗塞体积并改善了神经功能[12]。在经历氧-葡萄糖剥夺(OGD)的星形胶质细胞和神经元共培养物中，雷帕霉素增强星形胶质细胞自噬并且减少神经元凋亡，而用3-MA或抗Atg5小分子干扰RNA(siRNA)抑制星形胶质细胞自噬后增加神经元凋亡[13]。Wang等人观察到使用3-MA后缺血再灌注后的梗塞面积减小[14]。这些研究表明增强自噬加重了脑缺血再灌注损伤。

3 自噬通量与脑损伤

3.1自噬通量与TBI 对上述争议的一种解释是：如果自噬通量不受阻碍，增强自噬可能起到神经保护作用；但是当自噬通量受损时，增强自噬则可能起到神经损害的作用。许多研究对自噬的衡量标准都依赖于LC3-Ⅱ的水平，但LC3-Ⅱ浓度的升高不一定等同于自噬水平的升高。在一项模拟小鼠TBI的控制性皮层撞击脑损伤(CCI)脑损伤研究中，LC3-Ⅱ的增加并非来自自噬的增加，而是自噬通量的损害，这是由SQSTM1/p62水平升高所证明的，SQSTM1/p62通常在自噬通量正常的情况下被消耗[15]。由于自噬通量是异常蛋白质和细胞器降解所必需的，其破坏将导致其堆积而不是消除。

在对小鼠局灶性小脑病变TBI模型的研究中可以找到进一步支持自噬通量在决定自噬的神经保护或破坏方面起着一定作用的证据。在这项研究中，Beclin1杂合Becn1+/-小鼠相比于野生型小鼠p62水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-I比率降低，表明Becn1+/-小鼠中自噬通量受损。随后对自噬增强剂雷帕霉素对野生型和Becn1+/-小鼠的作用研究发现，用雷帕霉素处理的野生型小鼠与未接受雷帕霉素的野生型小鼠相比，产生的LC3-Ⅱ量明显更高，而产生的p62则明显更低，并且神经存活率与NSS评分升高。这些数据表明，当自噬通量正常时，促进自噬诱导具有神经保护作用，然而当自噬通量受损后有助于神经细胞的死亡[16]。

另外，有研究显示自噬通量是否受损取决于脑损伤的严重程度。Zeng等研究了不同严重程度的CCI后自噬和自噬通量的诱导变化[17]，在同侧皮质组织中，第1天和第3天LC3-Ⅱ的丰度以损伤严重程度依赖性的方式增加，轻度CCI后，自噬相关蛋白Beclin 1和ATG12-ATG5 复合物的增加，伴随p62/SQSTM1和自噬小体的减少，并观察到自噬溶酶体的增加，这一系列的数据表明自噬通量的增加。

3.2自噬通量与脑缺血性损伤 关于脑缺血后自噬通量，尚未使用类似TBI小鼠系的研究。 但是相似结果可以在大鼠和小鼠的心脏缺血再灌注(I/R)损伤的研究中找到。这些研究发现，当自噬通量不受损害时，诱导自噬可增强心脏保护作用，但是通过抑制溶酶体破坏自噬通量后诱导自噬无此保护作用[17]。

4 总结与展望

总的来说，尚不清楚的是急性TBI或脑缺血后抑制或增强自噬是否会产生有害或有益作用，因为所有组合均已在各种实验模型中进行了报道。但是似乎一致的结论是，可以减轻自噬体细胞内负担的干预措施(减少自噬体形成、刺激自噬通量、提高清除率)对急性脑损伤后具有神经保护作用。不足的是，由于缺乏高度选择性的自噬抑制剂和自噬增强剂来操纵自噬，最终的研究受到了阻碍。因此，在未来的研究中，使用高度选择性自噬干预药物或者细胞特异性转基因动物有助于我们更了解急性脑损伤中的自噬的变化，从而找到治疗或减轻急性脑损伤的干预靶点。