青蒿素及其衍生物抗真菌研究进展

2021-12-05骆万婷李海涛杨蓉娅

实用皮肤病学杂志 2021年1期

骆万婷，李海涛，杨蓉娅

真菌感染是全球性健康问题，侵袭性真菌感染每年导致＞150万人死亡。据估算，全球近10亿人患有皮肤、甲和头发真菌感染，超过1.5亿人患有严重的真菌疾病，对患者产生重大的或致命的影响。临床常用的抗真菌药主要为唑类，多烯类和棘白菌素类3类，抗真菌药的耐药问题已成为全球性棘手问题。此外，应用于农业的某些唑类杀菌剂，例如丙环唑或戊唑醇，具有与临床唑类药物相同的抗真菌作用机制，长期应用于农业领域可诱导产生耐药菌株，从而可以间接引起人类的感染耐药菌。因此，迫切需要开发新的抗真菌药，或筛选非专利药物库中具有抗真菌作用的药物。

1972年，中国科研人员成功地从黄花蒿中提取得到能有效抗疟疾的青蒿素。青蒿素属倍半萜类化合物，而青蒿素衍生物，如双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等，保留了至关重要的过氧基。目前，青蒿素及其衍生物在抗疟疾、抗肿瘤、免疫调节、抗病毒等方面研究广泛。近几年，青蒿素类药物抗真菌的作用和机制研究有所进展。本文就青蒿素及衍生物抗真菌方面的研究进行综述。

1 青蒿素及其衍生物对常见医学致病真菌的作用研究

1.1 念珠菌

青蒿素及其衍生物单用对念珠菌的作用不确切，作用机制可能是降低蛋白酶活性、磷脂酶活性，降低麦角固醇含量、干扰金属稳态等。

Galal等[1]使用改良版美国临床和实验室标准化委员会（National Committee for Clinical Laboratory，NCCLS）推荐方法对32种青蒿素类药物进行药敏试验，研究显示，青蒿素类药物对白念珠菌的效果不佳，其中青蒿素对白念珠菌ATCC 90028的最低抑菌浓度（minium ihibitory concentration，MIC）为50 μg/ml，半数抑制浓度IC50为8 μg/ml。Slade等[2]采用改良临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐方法对青蒿素、双氢青蒿素及双氢青蒿素缩醛二聚体进行药敏试验，发现这些药物对白念珠菌ATCC 90028，光滑念珠菌ATCC 90030，克柔念珠菌ATCC 6258效果不佳，但部分药物有效并存在优于两性霉素B的情况。Khatoon等[3]用青蒿叶提取物制备纳米银颗粒，其对白念珠菌ATCC 90028、光滑念珠菌ATCC 90030、热带念珠菌ATCC 750具有显著抗真菌功效，可显著降低蛋白酶和磷脂酶的活性，降低麦角固醇含量，并破坏细胞膜完整性，MIC90分别为120 μg/ml、80 μg/ml、90 μg/ml。Stylianou等[4]的研究中采用微量稀释法、吸光度测定、ATP水平测定3种方式联合确定青蒿素对白念珠菌SC 5314在6 h和24 h的MIC值范围为4.8×10-5～2.82 μg/ml，表明具有抑制作用。

Simm和May[5]以白念珠菌CaI4为研究对象，筛选了1 200种化合物以寻找干扰真菌金属稳态的现有药物，结果显示，青蒿素能够减少细胞内总铁以及不稳定的锌，而锌的总量不变。因此，推测青蒿素可能通过干扰细胞内锌池区室化或移动，或影响锌螯合而干扰锌和铁的稳态而抑制真菌生长。

Kaneko等[6]的研究表明，青蒿琥酯可以增强氟康唑对游离白念珠菌的抑制活性。De Cremer等[7]从1 600多种现有药物中筛选与咪康唑联用使对白念珠菌生物膜清除具有协同作用的药物，其中筛选出青蒿琥酯与咪康唑具有协同效应，随后咪康唑分别与青蒿素、双氢青蒿素及蒿甲醚的检测也显示对清除念珠菌生物膜具有协同作用。

新近研究中，Das等[8]通过研究青蒿素对游离状态及生物膜状态下7种不同念珠菌的抑制作用、代谢活性、生存能力及氧化应激的影响，发现青蒿素能促进真菌胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累积，对游离状态及生物膜状态下的念珠菌均有细胞毒性作用。该研究使用了新颖的多参数评估方法论证后发现，青蒿素对念珠菌的抑制作用呈剂量依赖性，在抗念珠菌生物膜方面具有潜在作用。

1.2 新生隐球菌

Galal等[1]的研究中，使用了32种青蒿素类药物对新生隐球菌ATCC 90113采用改良版NCCLS方法进行药敏试验，结果显示，脱水双氢青蒿素对新生隐球菌的抗真菌活性优于两性霉素B，MIC低至0.195 μg/ml。青蒿素衍生物β蒿乙醚和α蒿乙醚对新生隐球菌也具有显著抑制作用。而青蒿素对新生隐球菌抑制作用不及两性霉素B，MIC值为50 μg/ml。Slade等[2]也发现，双氢青蒿素及多种双氢青蒿素缩醛二聚体抗新生隐球菌ATCC 90113的抑制程度优于两性霉素B，IC50远低于两性霉素B。此外，该研究中，青蒿素对新生隐球菌的IC50为0.25 μmol/L，而两性霉素B对新生隐球菌的IC50为0.78 μmol/L，说明青蒿素对新生隐球菌的抑制作用优于两性霉素B。

最新研究中，Bairwa等[9]通过血红素传感器监测新生隐球菌胞内血红素水平，证实了青蒿素能降低胞内血红素并抑制新生隐球菌增殖。由于铁的摄取对于真菌繁殖、毒力至关重要[10]，而血红素是新生隐球菌重要的铁来源[11]，此项新研究结果推测了青蒿素抑制新生隐球菌的可能机制。

1.3 曲霉

Gautam等[12]发现，青蒿素对烟曲霉菌株Af 293的MIC50和MIC90分别为125和250 μg/ml，效果不佳。Slade等[2]发现，双氢青蒿素缩醛二聚体和单体对烟曲霉ATCC 90906整体效果也不佳。然而，青蒿素与伊曲康唑联用对烟曲霉进行体外抗药敏试验时，显示出了对烟曲霉的协同作用。为了解青蒿素对烟曲霉的分子作用，Gautam等[12]进一步研究了指数后期的烟曲霉孢子在MIC50浓度下暴露于青蒿素3 h的转录组和蛋白质组学特征，根据差异表达，推测氧化磷酸化途径中的线粒体NADH脱氢酶、细胞壁相关蛋白和酶、涉及麦角固醇生物合成的基因可能是青蒿素作用的潜在靶点。既往一项基于酵母模型的研究也提示NADH脱氢酶是青蒿素的直接靶标[13]，重要的是，烟曲霉、酿酒酵母和白念珠菌接触抗真菌药后并未观察到与氧化磷酸化途径有关的基因显著改变，这些不同于抗真菌药的基因表达变化可能是青蒿素与抗真菌药产生协同的重要原因。

戴京京等[14]探究鼠肺部感染烟曲霉后，青蒿琥酯对肺组织自噬相关蛋白表达的影响，结果发现青蒿琥酯注射组的肺组织病理切片中的孢子比感染组数量少且聚集在一起，未长出菌丝，青蒿琥酯组体外分离的真菌孢子的活性明显受到抑制。进一步研究发现，青蒿琥酯增强肺部巨噬细胞树突状细胞相关性C型植物血凝素1（den driticcell associated C typelectin-1，Dectin-1）、ROS、微管结合蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain-3，LC3Ⅱ）的表达，由此得知，青蒿琥酯可通过抑制烟曲霉生长和增强鼠肺巨噬细胞的自噬水平，对抗肺组织烟曲霉感染。随后，该课题组构建蜡螟感染烟曲霉模型，再次验证青蒿琥酯对自噬相关蛋白的表达影响，也证实了青蒿琥酯提高了自噬相关蛋白表达的影响[15]。

Dhingra等[16]通过对黄曲霉、黑曲霉等采用纸片扩散法进行药敏试验观察到，黄曲霉、黑曲霉在5 μg/ml的青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸作用下形成的抑菌圈与暴露于1 000 μg/ml的氟康唑、灰黄霉素下形成的抑菌圈大小相近。Shah等[17]制备青蒿素纳米悬液并采用纸片扩散法检测对黄曲霉、黑曲霉等微生物的作用，研究发现青蒿素纳米悬液对黄曲霉、黑曲霉具有较好抑制活性，MIC分别为0.19 mg/ml、0.33 mg/ml。

1.4 卡氏肺孢子菌

有研究报道，低浓度（0.5 μmol/L）青蒿素即可对卡氏肺孢子菌产生显著体外抑制作用，且高浓度（100 μmol/L）的青蒿素对貂的上皮样肺细胞系未观察到明显作用，提示其抑制肺孢子菌同时对正常的肺上皮细胞无明显影响[18]。双氢青蒿素、青蒿琥酯对卡氏肺孢子菌也有抑制作用[19]，50 μmol/L的双氢青蒿素对肺孢子菌的抑制率与15 μmol/L的喷他眯相似[20]。双氢青蒿素治疗大鼠卡氏肺孢子菌肺炎的体内研究也显示有效[21]。研究发现，双氢青蒿素和青蒿琥酯分别作用于卡氏肺孢子菌2 h后，表面微绒毛开始脱落变形，随着作用时间延长，细胞膜上出现大小不等的凹陷性损伤，甚至内部结构外露，与喷他脒作用后细胞膜的蜂窝状空洞结构相似[22]。叶彬等[23]用双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯治疗实验大鼠肺孢子菌肺炎，并探究治疗实验结束后鼠肺中卡氏肺孢子菌 5SrRNA基因、线粒体rRNA大亚基基因、胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因的影响，发现3种青蒿素衍生物可破坏肺孢子菌胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因，双氢青蒿素可致 5SrRNA基因、线粒体rRNA大亚基基因序列发生变异。

1.5 尖孢镰刀菌

有研究报道，5 μg/ml的青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸作用于尖孢镰刀菌形成的抑菌圈与暴露于1 000 μg/ml的氟康唑、灰黄霉素下形成的抑菌圈大小相近，其中青蒿素的抑制作用优于青蒿乙酸、青蒿酸[16]。Buragohain等[24]合成了9种青蒿素新型氟芳烃衍生物，检测了青蒿素与这些衍生物对真菌尖孢镰刀菌的抗真菌活性，结果发现，青蒿素和4种新合成化合物的抑制率高于70%，另外5种化合物的抑制率高于57%，青蒿素的抑制活性高于新合成的化合物。

1.6 皮肤癣菌

刘碧凤等[25]观察到青蒿酯钠对铁锈色小孢子菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌有不同程度抑制作用，其中抗铁锈色小孢子菌显著，MIC低至0.625 mg/ml。金慧玲等[26]报道，青蒿琥酯对石膏样小孢子菌、红色毛癣菌等癣菌的MIC为0.9%～1.2%，随后用1.5%青蒿琥酯外用对豚鼠体癣模型，实验组查菌阳性率数明显低于对照组。由此推测，青蒿素类药物或对多种癣菌有抑制作用。

1.7 酿酒酵母

既往由于缺乏良好的模型研究青蒿素类药物的作用机制，对青蒿素类的生物学作用了解甚少且存在争议。10余年前研究铁和青蒿素相互作用时偶然发现酿酒酵母可被青蒿素抑制，随后一直采用酿酒酵母作为模型探究青蒿素及其衍生物在活细胞中的作用。研究发现青蒿素、双氢青蒿素、青蒿酸和青蒿琥酯对酿酒酵母细胞均具有抑制作用，其抑制作用途径可分为线粒体介导途径和血红素介导途径[27]。基于酿酒酵的研究显示，青蒿素能够使线粒体膜去极化，破坏线粒体的正常功能[28]，其中NADH脱氢酶是青蒿素的直接靶点，青蒿素对线粒体的电子传递链和随后局部产生的活性氧损伤起了重要作用[13]。青蒿素类中重要的过氧键会因血红素而断裂，血红素降低能明显增强青蒿素类药物的抗线粒体作用[27]。