微小RNA与糖尿病视网膜病变

陶丹，倪宁华

（1.昆明市儿童医院/云南省儿科疾病临床医学中心/云南省儿童医学中心，云南 昆明 650032；2.云南省第一人民医院，云南 昆明 650031；3.昆明理工大学医学院，云南 昆明 650500）

Lee等[1]于1993年率先于线虫发育期间检出了首个微小RNA(microRNA，miRNA)，并将其被命名为lin-4。之后，学者们自多个生物物种内皆检出了miRNA。截止当前在人类基因量中已完成克隆排序的数量超过了800个，预估miRNA基因量＞1000个，此外所调控的人类基因所占比例已超过了30%[2]。miRBase数据库（构建方为英国Sanger研究所）[3]在记录miRNA序列诸数据库中，其最具权威性，截止当前，此数据库所收录的成熟miRNA序列信息类型已达25141种，涉及到193个物种。在动物基因总量中，miRNA为1%至5%占比[4]，就人类基因组而言，估计编码mRNA量在1000个以上，判断miRNA所调控的蛋白编码基因占比已达1/3以上[5]。

miRNA是一类单链ncRNA（非编码RNA）小分子，此分子长度约为20-24个nt（核苷酸），转录自内源性发夹型[6]。对于任何蛋白质，miRNA皆无编码作用，其在调控基因表达方面体现出一定的新颖性。单个miRNA可对若干个mRNA表达施以有效调节；而且六成以上的mRNA含若干条miRNA的结合位点，能够同时与若干miRNA发生交互反应。miRNA存在以下特征表现：高度特异性、保守性、表达的时序性。基于生物学层面分析，miRNA存在十分复杂的合成过程[7]，首先，在细胞核内，在RNA聚合酶Ⅱ介导下，经转录生成“发夹”pri-miRNA，此物质具备特征性茎环结构，被Drosha/DGCR8此蛋白复合体核心区域基因识别与切割，产生premiRNA。核-胞质穿梭蛋白对其具识别性，并对其迁移至胞质具促进作用，受到核糖核酸Ⅲ Dicer的刺激，等到留存住较短的(21-23)nt双链RNA序列，再和Ago蛋白结合，完成向RISC（RNA诱导沉默复合体）转化。此复合体的成熟态能够互补配对结合靶mRNA的3’非编码区(UTR)，对靶mRNA表达进行阻抑，进而抑制或降解靶mRNA翻译。

近期，证实对于糖尿病（diabetes mellitus，DM），miRNA发挥着关键性的参与与调控作用。miRNA同T2DM存在显著相关性。其可对胰岛B细胞功能和胰岛素的释放施以影响。经研究，学者Latreille等发现[8]，对于胰岛B细胞生成胰岛素的功能，miRNA-7a发挥着负向调控效应，将小鼠B细胞所含miRNA-7a作敲除处理，可以提升胰岛素分泌量。在miRNA-187表达量方面，同正常群体相比，T2DM患者偏高，此基因表达提升，能够积极调控HIPK3，进而使胰岛素释放受抑，可见经由抑制miRNA-187表达，可对T2DM施以有效治疗[9]。Karolina等[10]对GK大鼠开展了相关研究，结果表明，相较于健康组大鼠，糖尿病组的实验动物在29类miRNA的表达上，表现出了明显的差别，这些miRNA中，脂肪组织内miRNA-222以及miRNA-27a显示表达增强，肝组织内的miRNA-195以及miRNA-103也显示为表达上调。miRNA-10b于肌肉细胞内的表达偏低[11]，miRNA-146a于外周血单核细胞内的表达偏低[12]。此外，Kong等[13]对DM患者血浆内miRNA进行测定的结果显示，miRNA-9、miRNA-3757、miRNA-29a、miRNA-146、miRNA-30d、miRNA-124a与miRNA-34a皆出现了变化。miRNA-320能够调节T2DM患者细胞中由高糖刺激所致的基因表达量。受到高糖刺激，血管内皮细胞（VEC）的VEGF、ET-1表达皆呈升高表现。

借助微阵列技术，学者Xu等[14]率先自成年小鼠内提取出80个类型不同的miRNA，其中23个特异性表达于视网膜。近些年，受到NGS（新一代测序技术）发展与应用的影响，miRNA检出的敏感性显著提升，于视网膜内检出了250个以上的miRNA[15]。

视网膜新生血管的产生，还有血管通透性提升皆为糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy，DR）形成的关键机制。VEGF在DR病理反应中发挥着关键性的影响，若此因子水平增强，能够促进血管生成，同时可提升血管通透性。待VEGF结合了细胞表面相应受体，可使细胞中若干信号转导通路活化，促使内皮细胞增殖、迁移以及新生血管腔的产生。Kovacs等[16]对比检测了正常和糖尿病大鼠视网膜组织的miRNA，结果发现86种miRNA在糖尿病大鼠视网膜中有显着差异性表达，这与视网膜疾病的发生密切相关。还证实因VEGF诱导的6类miRNA（包括miR-17-5p、miR-155、miR-18a、miR-31、miR-21与miR-20a）皆高表达于DR大鼠的REC（视网膜血管内皮细胞），表明miRNA可能经由上调VEGF表达而影响DR形成的病理活动。经研究，McArthur等[17]证实，miR-200b低表达于高糖干预的内皮细胞与DM大鼠视网膜内，而其施以直接靶向作用的VEGF基因的蛋白、mRNA表达水平皆上调。学者Murray等[18]对大鼠视网膜Müller细胞采取了诱导处理，所用诱导剂为miRNA-200b增强剂，结果发现，同存在一定联系关的4-羟基壬烯醛（4-HNE）此氧化应激源显示为程度不等的增加，可见，在视网膜神经细胞氧化应激（OS）机制中，miRNA-200b发挥着抗细胞凋亡效能，同时发现miRNA-200b还能作用下游的抗氧化1(oxidation resistance 1，Oxrl)基因，从而对DM起到保护作用。另外，内皮细胞中miRNA-1表达下降，使得其靶基因ET-1与FN（纤连蛋白）水平提升，引发眼底视网膜血管收缩和纤维沉淀[19]。

NF-κB在REC增殖以及表达诸多类型的炎症相关基因方面，发挥着调控枢纽作用，同DR的形成、进行存在显著联系。miRNA和视网膜炎性反应存在联系。对于NF-κB炎症通路，miR-146a起到一定调节作用[20]。相关实验结果表明，对DM小鼠的REC具备诱导作用的miR-146、miR-21、miR-132以及miR-155存在不断升高表现，导致REC-NF-κB途径的活化，从而促进其下游基因MCF-1以及黏附因子-1的转录提升，对视网膜炎性反应施以进一步激发。Ye等[21]研究发现miR-146a在高糖培养的HRCEC中表达下降,而过表达miR-146a能够使TLR4/NF-κB以及TNF-α下调，表明在DR炎症机制中miR-146a参与了NF-κB活化的负性调节。Feng等[22]研究发现miR-146a在1型糖尿病大鼠模型中REC的表达减弱，纤维黏连蛋白（FN）则表达上调，促使视网膜微血管内皮细胞迁移、损伤，引起相关DR的病理改变。

对于DR而言，其神经损伤改变以神经凋亡、神经胶质细胞反应性增生为主。先出现神经胶质细胞机能异常[23]、神经元细胞凋亡，再发生视网膜内皮细胞与周细胞的凋亡[24]。在DR中，若p53活化，会增强miR-34家族(miRNA-34a/b/c)表达，表明，miR-34家族同由p53诱导所致的REC凋亡存在一定联系。He等[25]敲除老鼠miRNA-34基因发现p53诱导的细胞凋亡被阻滞，表明在p53调控网络中，miRNA-34扮演着重要的角色。通过研究，Kovacs等[73]也发现miRNA-34c在糖尿病大鼠视网膜组织及视网膜色素上皮细胞中表达有显著上调，同时发现在DR中有p53的活化，因此认为由miRNA-34家族成员介导的p53诱发的细胞凋亡和神经退变参与了DR的发生发展。

循环miRNA指的是血清、血浆等体液样品内的miRNA。循环miRNA稳定存在且持续表达于人类外周血内，具备稳定性[26]、组织特异性、可重复性，同时可经非创伤性途径获得[27]。基于此类表现，循环miRNA具备成为诊断临床各类疾病的新型生物标志物的潜力[28]。Chen等[29]的研究结果显示，DM血清和血细胞所含miRNA中有84类是相同的，对于DM患者而言，其血清miRNA改变相较血细胞miRNA改变特异性、敏感性皆更强。

现今已有大量循环miRNA被当做生物标志物用在其他疾病的诊断中。通过研究，Wulfken LM等[30]发现，可将miR-1233当做肾细胞癌的潜在生物标志物。经研究，Luo[31]发现，肝癌患者血清样本内存在miR-221高表达表现。Lee等[32]的研究结果显示，可通过miR-146b、miR-222来标志甲状腺癌复发。Li S等[33]对于早期检测高血压具备标志价值。Zampetaki A等[34]的研究显示，miR-15a、miR-28-3p、miR-29b、miR-223与miR-126等具备早期诊断T2DM价值。

DR中患者的视网膜细胞、外周血血清内也分布着大量异常表达的miRNA[35]，这些miRNA在DR的发生发展中起到了重要的作用,有的可以促进DR的发生，有的对DR发生起到抑制作用。目前的研究主要集中在动物模型中表达的组织miRNA，关于miRNA在DR疾病发生发展中的分子机制所见较少。虽然目前的研究已经揭示了miRNA的表达与DR的发展之间的联系，但miRNA可否作为DR的早期预警、早期诊断及早期干预的生物学指标尚无定论。