鹅痛风型星状病毒感染的诊断与防治研究进展

邓 丽，刘保国，杭柏林，2*

（1．河南科技学院动物科技学院，河南 新乡 453003；2．扬州大学兽医学院，教育部禽类预防医学重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室，江苏 扬州 225009）

2016~2017年，中国多个省份（如山东、江苏、安徽、河南、河北、湖南、辽宁、福建、四川和广东等）的鹅养殖场暴发1种以内脏和关节出现尿酸盐沉积为主要临床特征的新发疾病，造成雏鹅的大量死亡，给养鹅业带来巨大的经济损失[1-3]。通过病原分离鉴定是鹅星状病毒（geese astrovirus，GAstV）感染[4]。目前，已经开发许多方法可用于鹅痛风型星状病毒感染的诊断，但是在治疗上仍缺乏有效的药物、预防上也缺乏商业化的疫苗。因此，加强鹅痛风型星状病毒感染的深入研究具有重要意义。文章综述鹅痛风型星状病毒感染的诊断与防治，以期为鹅痛风型星状病毒感染的防控提供参考。

1 鹅痛风型星状病毒概述

星状病毒（astroviruses，AstV）属于星状病毒科，为无囊膜、二十面体、单股正链RNA病毒[5]。根据感染宿主的不同，将星状病毒分为哺乳动物星状病毒属（mamastroviruses，MAstVs）和禽类星状病毒属（avastroviruses，AAstVs）[6-8]。哺乳动物星状病毒包括人、猫、猪、羊和水貂星状病毒，有33个基因型（MAstV 1~33）；禽类星状病毒包括鸡、鸭、火鸡星状病毒及禽肾炎病毒，有7个基因型（AAstV 1~7）[9]。星状病毒的基因组全长差异较大，约6.8~7.9 kb，包括5'UTR、3个开放阅读框（ORF1a、ORF1b、ORF2）、3'UTR及多聚腺苷酸（polyA）尾[10]。在不同的AstV中，ORF1b基因长度差异较小，并且其编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）在AstV蛋白中最保守[11]。ORF2的核酸序列可用于星状病毒的演化分析[12]，是星状病毒基因分型的主要依据[13]。ORF2主要有2个区域，N端区域编码的衣壳蛋白（在宿主和血清型之间高度保守）能与宿主抗体和补体发生反应，调控宿主免疫应答[14-16]；C端区域在宿主和血清型之间高度变异，编码蛋白含有产生中和抗体的抗原位点，能与宿主细胞受体发生特异性结合[14-15]。星状病毒较为稳定，在水体中持续存在[17]，对苯扎溴铵、酚类、季铵盐类等消毒剂有很强的抵抗力，对热处理稳定，能抵抗60℃10 min，对氯仿、胰蛋白酶等制剂不敏感，对酸稍不稳定，但能被0.3%甲醛、1.5%卫可、90%甲醇完全灭活[12,18]。

Niu等[19]首次从病鹅组织中分离出1种新型的鹅源星状病毒。在国内，不同研究者对该病毒有着不同的命名，如新型鹅星状病毒[20]、鹅星状病毒[19]、鹅肾型星状病毒[2]等，其中以新型鹅星状病毒居多。鹅星状病毒FLX的变异病毒毒株可能在鹅痛风病中起关键作用[20]。但张玉杰等[20]认为，导致鹅痛风的可能是2个不同种的鹅星状病毒（如FLX株的变异病毒SCCD株和新型鹅星状病毒SDPD株）发生混合感染的结果，因为单一毒株攻毒后未获得痛风症状，而两种毒株混合感染后获得了痛风症状。这些病毒毒株均是新基因型的鹅星状病毒，属于禽星状病毒基因3型，与其他禽类星状病毒有较大差异，全基因组的同源性低于70%，ORF2编码的衣壳蛋白氨基酸序列的同源性低于70%，与禽星状病毒属的其他毒株遗传距离较远[2]。根据ORF2的差异，将鹅星状病毒分为基因Ⅰ群（如鹅星状病毒FLX）和基因Ⅱ群（如新型鹅星状病毒）。新型鹅星状病毒的实验室宿主短缺，虽然能在鹅胚和鹅胚肾细胞中增殖，但含量较低[21-22]，能在鸡肝细胞中培养，但无细胞病变[21,23]。新型鹅星状病毒SDPD株能在LMH细胞（鸡肝癌细胞）上稳定传代，但不能在鸡胚和鹅胚上稳定增殖；而鹅星状病毒FLX株的变异病毒SCCD株能在鹅胚上稳定增殖，且毒力较强，能引起10日龄鹅胚规律性死亡[20]。在鹅的肾、脾、肝中带毒量较高，其次是胰腺、肺和肠道（十二指肠）、心和脑[2]。鹅星状病毒不产生血凝反应[24]。

鹅星状病毒外衣壳结构蛋白能自发形成病毒样颗粒，具有极好的抗原性和安全性，能诱导鹅机体产生较强的体液免疫反应，免疫后的鹅能抵抗星状病毒的感染[25]。鹅星状病毒能诱导机体产生中和抗体，针对相应毒株能产生较好的中和效应，而遗传距离较远的不同毒株之间无交叉中和效应[20]。徐蓉等[26]从临床病料中分离到1株致鹅痛风的鹅星状病毒JSHA株，经分析发现与火鸡星状病毒2型和鸭星状病毒2型的亲缘关系较近，推测其可能由鸭演变而来，因为鸭、鹅的生存环境为病毒的跨种传播创造了条件。

2 鹅痛风型星状病毒感染的诊断

2.1 流行病学诊断

该病主要发生在4~20日龄的雏鹅[2,4,19]，最早可在1日龄发病[21]。日龄越小，发病率和死亡率越高[20]。雏鹅多在5日龄开始发病，10~15日龄为死亡高峰，至20日龄时，死亡率可达20%~30%[1]，最高可达70%[25]。病鹅的死淘率高达40%以上，幸存的病鹅预后体质较差[27]。30~50日龄鹅感染后一般无明显的死亡，多因继发细菌感染而使死亡率增加[20]。鹅星状病毒2种毒株的混合感染多见于15日龄以下的鹅，群体痛风发生率和死淘率均较高；而单纯新型鹅星状病毒感染多见于30~50日龄鹅，群体痛风发生率和死淘率均较低[20]。鹅痛风型星状病毒主要通过消化道和呼吸道等进行水平传播[4,22]。集中孵化造成的水平传播可能是雏鹅早期发病的关键因素[20]；也可通过种蛋发生垂直传播[28]。一年四季均可发生本病，以冬春季节多发[29]，每年11月至次年5月份为高发季节，其他时间较少发生，可能是通风和保温措施而导致的发病[30]。

2.2 临床症状诊断

患病雏鹅羽毛稀疏[29]、精神沉郁、采食量减少[31]、关节（跗、趾、指）肿大、有白色游离尿酸盐沉积[20,31]、卧地不起、跛行或瘫痪[1,27]、喜欢蹲伏、双蹼不敢着地、闭目嗜睡，全身不自主地震颤[20]、腹泻、排白色[1,27]或黄绿色[29]稀便，有的剧烈腹泻，泄殖腔周围羽毛污秽、糊肛等现象严重[20]。随着病情发展，病鹅体重减轻、死亡数量逐渐增加[21]，雏鹅生长发育迟缓[32-33]、易发生细菌感染[21]，常因消化吸收障碍而成为僵鹅[20]。感染后的康复鹅易产生免疫抑制[34]。病程持续7~10 d[25]。部分雏鹅在攻毒7 d后，出现角弓反张等神经症状后很快死亡[35]。

2.3 病理变化诊断

心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胸腹膜、输尿管、关节腔、腿肌、胸肌、腺胃等部位有尿酸盐沉积。肾脏出血、肿大[1,23,34]；心包增厚，有白色结晶物附着或包被，俗称“绒毛心”[36]；肝脏肿大、出血[29]；肺脏淤血、水肿、暗红色[37]；非化脓性脑炎[34]；肠壁稀薄、内含水样粪便；关节面及关节软骨组织轻微溃烂、坏死[29]。部分病鹅有肠道栓子（类似于小鹅瘟）[21,36,38]；心脏、胆囊膨大[21]；脾脏肿大[36]、出血严重、有灰白色坏死灶[39]。部分病鹅在皮下、腺胃内表面和胆囊内有尿酸盐沉积[20,39]，部分在肠系膜和气囊上也有不同程度的尿酸盐沉积[29]。尿酸盐沉积时呈点状或片状分布[40]，呈白色或黄白色粉末状[41]或黏稠状[29]。不同毒株进行人工攻毒后，单一毒株感染鹅未见痛风现象，仅肝损伤、肾肿以及输尿管肿胀，而混合毒株感染鹅有痛风现象[20]。

在组织细胞学上，心肌细胞变性坏死[20]，心肌纤维颗粒变性；肺脏坏死，局部有针状结晶结构，巨噬细胞和淋巴细胞浸润[39]，肺间质充血、出血，有少量炎性细胞浸润；脾脏部分淋巴细胞坏死、淋巴细胞数量减少[37]，部分含有大量模糊的针状或梭形结晶结构[39]，有大量红细胞浸润；肝细胞内可见程度不等的胆红素[39]，肝细胞脂肪变性、空泡变性，有尿酸盐沉积；肾小管管腔内有大量均质红染的蛋白尿[39]，肾小管上皮细胞急性变性、坏死（核浓缩）、脱落，管腔内有尿酸盐沉积，间质出血，肾小球肿胀，部分肾组织间质中有淋巴细胞和单核细胞浸润，血清中尿酸含量增加[1,12,21]，肾小管上皮细胞受到损伤后导致体内尿酸盐排泄发生障碍，久积于体内而形成痛风[20]；法氏囊淋巴滤泡生发中心扩大，其内的淋巴细胞部分坏死，淋巴细胞数量减少[39]；胰腺出现局灶性坏死[39]。

2.4 病原学诊断

2.4.1 病原的分离与鉴定

可用鹅胚肾细胞或9~13日龄的鹅胚经绒毛尿囊膜或卵黄囊途径接种鹅胚进行鹅星状病毒的分离[21]。多次传代后，鹅胚死亡，尿囊膜增厚，胚体明显出血[22]，并伴有生长抑制[12]，鹅胚肾细胞出现变圆、皱缩、脱落、聚集等细胞病变现象[22,42]。姜晓宁等[1]用13日龄鹅胚成功从临床样本中分离到病毒，鹅胚经绒毛尿囊腔途径感染病毒后，3~5 d出现90%的胚体死亡，胚体尿囊膜增厚，死亡鹅胚全身皮肤呈点状出血；胚体腹膜有点状出血斑，肝脏、肾脏、肺脏均呈现点状出血。张玉杰等[20]将处理病料经绒毛尿囊膜途径接种10日龄鹅胚，传4代后开始呈现规律性死亡，多在48~120 h死亡，代次越高，死亡时间越靠前，胚体水肿、通体发红；尿囊膜增厚、水肿、膜上有乳白色沉淀；肝脏有斑驳样坏死。病料接种的LMH细胞没有细胞病变，但通过核酸证实有病毒的存在。林裕胜等[43]利用11日龄鹅胚分离到1株新型鹅星状病毒FJ-NP株，其在鹅胚上传代后，鹅胚呈全身广泛性出血点和出血斑，肝脏有出血点，尿囊膜增厚。李甜甜等[39]用9日龄鹅胚进行鹅星状病毒的分离，发现死亡鹅胚体严重水肿、紫褐色充血出血、尿囊膜上有大量尿酸盐沉积。通过电镜观察星状病毒特有的五角或六角结构和28~30 nm的直径来辅助证明星状病毒的存在[44]。Yuan等[5]利用电镜在鹅肝切片中观察到直径约30 nm的病毒颗粒，但未能看到特有的星型形状。

2.4.2 免疫学诊断

（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）。

阮菁等[45]建立1种检测鹅星状病毒衣壳蛋白抗原的ELISA方法，特异性较好，只能检测出鹅星状病毒的抗原，不能检测出新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型、小鹅瘟病毒等其他病毒的抗原；灵敏度高，最低检测到抗原标准品的浓度为0.007μg/mL；可用于泄殖腔拭子、新鲜组织病料、病毒培养后的细胞裂解、鹅胚尿囊液和疫苗等样品的检测。张鑫宇等[46]和刁有祥等[47]均建立1种检测鹅星状病毒抗体的间接ELISA方法。

（2）琼脂扩散试验。

琼脂扩散试验的操作简单、可适用于基层单位使用。张凌云等[34]用琼脂扩散试验检测了鹅星状病毒亚单位疫苗免疫后血清抗体效价。

2.4.3 分子生物学诊断

（1）常规RT-PCR。

姜晓宁等[1]建立的1种RT-PCR方法成功对临床143份样本进行检测，阳性率为96.5%。李阳等[33]根据鹅星状病毒ORF1B设计了一对特异性引物，建立1种RT-PCR方法，具有快速、廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点。

（2）实时荧光定量PCR。

白彩霞等[31]根据鹅星状病毒毒株（MH052598.1）ORF2基因序列设计1对特异性引物建立1种SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，该方法特异性良好，不能检测出禽白血病病毒、血清4型禽腺病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和鸡传染性贫血病毒等；敏感性较高，最低模板检测含量为3.75×101拷贝/μL；重复性高，组内和组间重复性试验变异系数均小于1%；对32份临床样本的阳性检出率为43.75%，高于常规PCR的阳性检出率（18.75%），两者的阳性符合率为100%。邱思语等[2]根据鹅肾型星状病毒的ORF1b基因保守区域设计一对特异性引物建立1种SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，该方法敏感性高，最低检测限为24.2拷贝/μL，比普通PCR高100倍；特异性强，对禽流感H9N2、鹅副黏病毒、鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒均无交叉反应；重复性好，批内和批间变异系数均小于2.5%；对临床样本检测，检出率比普通PCR高19.5%。Yuan等[24]建立了TaqMan探针法检测GAstV的实时荧光定量RT-PCR方法，需合成针对性很强的核酸探针，成本较高。苏世博等[48]以ORF1a的保守片段设计特异性引物及探针，建立的TaqMan荧光定量PCR方法可快速、特异地检测鹅源星状病毒，且检出率明显高于常规RT-PCR方法。孟凯等[49]建立1种多重荧光定量RT-PCR方法，可特异性检测新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒，能区分单一感染和混合感染。

（3）环介导等温扩增技术。

环介导等温扩增技术（LAMP）是1种反应过程始终在恒定温度下进行的核酸扩增方法，具有简便、快速、敏感、不需要昂贵仪器的特点。张玉霞等[27]根据鹅AstV ORF1b基因的保守序列设计1组特异性的LAMP引物，建立了快速检测鹅AstV的LAMP方法，特异性好，仅能扩增鹅AstV，而对鹅细小病毒、鹅副黏病毒、鸭坦布苏病毒及鹅源H9N2亚型禽流感病毒均不能扩增；灵敏度高，能够检测到的最低模板浓度为1 mg/L；符合率高，临床样本检测结果与常规RT-PCR方法的阳性符合率为95.65%。

（4）高分辨熔解曲线检测方法。

高分辨熔解曲线（HRM）检测方法是近年来新开发的1种新的核酸检测技术，在常规PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。董嘉文等[50]建立的1种HRM检测方法可以区分鹅星状病毒1型与2型，具有快速、不需要探针、特异性强、准确度高、高通量等特点。

3 鹅痛风型星状病毒感染的防治

3.1 鹅痛风型星状病毒感染的预防

加强饲养管理，控制或不使用核蛋白和嘌呤碱含量高的动物性饲料，适当增加饲料中维生素A或胡萝卜素的含量，同时保证饮水充足、卫生，不要长期或过量使用对肾功能有影响的药物[29]。不同批次之间应延长空舍时间，同时严格做好种蛋、孵化设施、环境的消毒工作，避免病原传播具有关键作用。对种蛋和孵化场所进行严格的熏蒸消毒后新出生雏鹅痛风的发生率大大降低[28]。病死鹅要按相关法规要求进行无害化处理。改变饲养方式，从地面平养、集中育雏转变为高床架养或多层笼养，降低饲养密度[28]。

目前，常规的抗菌、抗病毒方法治疗鹅星状病毒感染均无效，而且还没有商业化疫苗用于预防鹅星状病毒感染[21]。但已经有多种试验性疫苗的研发报道，如鹅星状病毒样颗粒疫苗[25,51]、鹅星状病毒灭活疫苗[52]、鹅星状病毒亚单位疫苗[34]、鹅星状病毒二价灭活疫苗[53-54]、新型鹅星状病毒复合疫苗[55]。荣雪路等[56]用表达的鹅星状病毒衣壳蛋白作为亚单位疫苗免疫种鹅，用琼脂扩散试验检测抗体效价，结果免疫种鹅血清抗体及其所产鹅蛋卵黄抗体的效价均不低于3 log2，对孵化出的雏鹅在3日龄进行人工攻毒，14 d后有母源抗体的雏鹅均存活，保护率为100%。张清水[22]将鹅星状病毒SD01株在鹅胚中传至60代时，发现其已经充分被致弱，在雏鹅体内连续传代未出现毒力返强现象，将其经皮下免疫雏鹅，10 d后用强毒攻击，结果弱毒株的保护率为100%。

张立武等[57]制备的鹅星状病毒精制卵黄抗体可在鹅整个生长周期内有效预防鹅星状病毒感染。宋杨等[58]制备的鹅星状病毒卵黄抗体对强毒的攻毒保护率达到100%。李守军等[59]制备的鹅星状病毒卵黄抗体对强毒的攻毒保护率为90%。徐丽娜等[53]制备的鹅星状病毒二价卵黄抗体对强毒的攻毒保护率为90%。唐熠等[60]制备的鹅星状病毒卵黄抗体对强毒的攻毒保护率为100%。

3.2 鹅痛风型星状病毒感染的治疗

痛风时，可使用一些常用药物（如护肾利尿药）以促进体内尿酸排出[61]，从而缓解症状，如饮水中添加肾肿解毒药物，3~5 d后症状可有所缓解，同时添加5%葡萄糖，效果会更好[29]。张凌云等[34]用鹅星状病毒亚单位疫苗免疫后制备的卵黄抗体在2个发病鹅群中应用10 d后，注射组鹅群的死亡率为5.4%和6.4%；而不注射鹅群为40.7%和36.9%，认为卵黄抗体能有效治疗鹅星状病毒感染。鹅星状病毒卵黄抗体对发病早期（如个别鹅出现精神沉郁、采食量下降）的鹅至少有80%的治愈率，但对发病中后期（全群发病、出现死亡病例）的鹅治疗无效[57]。抗体用于特异性治疗，但效果不佳，原因可能在于病毒难以培养，且病毒滴度不高[21,62]，注射单一新型鹅星状病毒高免卵黄抗体亦无明显效果[20]。陈琳[63]认为，雏鹅痛风的根源在于脾肾两虚、运化不畅，最终导致肝肾阴虚、湿热内蕴，治疗时应以健脾利湿、清热解毒、利水通淋为主，应用党参、白术、茯苓、栀子、黄芩、黄连、板蓝根、川木通、车前草、滑石等，加水煎煮3次，合并煎液，连用5 d后，死亡降至2~3只/d，鹅群基本恢复健康。李海利等[64]开发1种中药注射剂（黄芩6份、茵陈蒿6份、石韦20份、栀子16份、金银花12份、黄芪40份、蟑螂10份、苦参3份、萹蓄2份）用于治疗新型鹅星状病毒引起的鹅痛风，可显著降低血清中尿酸盐浓度，肌注4 mL/只，2次/d，3 d后病情控制，4~5 d后鹅群恢复正常。

4 展望

未来应从以下几方面对鹅痛风型星状病毒进行研究：（1）单一毒株感染还是两种及以上毒株混合感染；（2）开发广谱疫苗；（3）新型鹅星状病毒是否由其他星状病毒跨宿主传播而来，或变异（如重组）后致病；（4）动物源的星状病毒对人类是否具有致病性；（5）传代后全基因组分析发现了衣壳蛋白上一些氨基酸位点突变，并降低对鹅的致病性，可尝试研制出相应的弱毒疫苗；（6）致病机制；（7）通过母源抗体能否预防雏鹅新型鹅星状病毒感染。